摘要：沙蘆草又稱蒙古冰草，具有抗旱、抗寒、抗病、耐鹽堿等優(yōu)良性狀，是荒漠草原和典型草原地帶沙地主要植被之一。沙蘆草種子存在發(fā)芽率低、發(fā)芽持續(xù)時間長等野生特性，這對沙蘆草人工種子繁育和生產(chǎn)利用造成一定程度的影響。為探究沙蘆草種子休眠機制，試驗分別用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮等 5 種有機溶劑和純水對沙蘆草種子稃殼進行浸提，利用白菜種子發(fā)芽試驗測定各提取相的抑制性，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對 5種有機溶劑浸提液進行分離鑒定，確定浸提物質(zhì)的種類和性質(zhì)。結果表明：沙蘆草種子稃殼的各相浸提液對白菜種子的發(fā)芽率、根長及苗高均有不同程度的抑制作用，其中抑制作用最強的是水相，其次是乙酸乙酯相和甲醇相;通過GC-MS 檢測，發(fā)現(xiàn)沙蘆草種子稃殼中存在烷類、醇類、酯類、酮類、苯類、酰胺、縮醛、酸類和酚類等 9 類 32 種有機化合物，其中醇類、酮類和烷類物質(zhì)的含量相對較高，且大部分為水溶性物質(zhì)。因此，沙蘆草種子稃殼中存在的醇類、酮類和烷類等可溶性物質(zhì)是引起沙蘆草種子休眠的主要原因之一，該研究可為尋找沙蘆草種子休眠破除方法提供理論依據(jù)。
關鍵詞：沙蘆草;休眠;抑制物質(zhì);GC-MS
沙蘆草(Agropyron mongolicum)又稱蒙古冰草，屬禾本科(Gramineae)小麥族(Triticeae)冰草屬(Agropyron)多年生草本植物。沙蘆草作為我國二級瀕危保護植物和農(nóng)作物野生近緣種，具有抗旱、抗寒、抗病、耐鹽堿等優(yōu)良性狀，因此在飼喂家畜、生態(tài)保護和遺傳育種方面具有重要價值，同時也具有較好的生產(chǎn)性能，是改善荒漠草原、建植人工草原的優(yōu)良牧草[1]。
但沙蘆草種子存在發(fā)芽率低、發(fā)芽持續(xù)時間長等野生特性，尤其新收獲的沙蘆草種子，發(fā)芽率只有 10% 左右[2]，且出苗時間較長，這對沙蘆草人工種子繁育和生產(chǎn)利用造成一定程度的影響[3]，因此探究沙蘆草種子休眠的原因可為之后打破其休眠并進行品種選育、種質(zhì)資源保存等育種工作奠定一定的基礎。近年來，對于沙蘆草的研究主要集中在其抗逆性及相關基因表達[4-6]、遺傳多樣性分析[7-8]及染色體加倍[9-11]等方面，但關于沙蘆草種子休眠與萌發(fā)特性的研究鮮有報道。種子休眠是指具有活力的種子處于適宜萌發(fā)的條件下而不能正常萌發(fā)的一種生理現(xiàn)象，它是植物長期適應環(huán)境變化的結果，也是植物在系統(tǒng)發(fā)育過程中為了抵抗不良生存環(huán)境而形成的一種生物學特性[12]。
一般而言，禾本科植物種子休眠與種子自身的生理狀態(tài)密切相關，主要由于種子中存在著某些抑制種子發(fā)芽的物質(zhì)，如氮、氰化氫、乙烯、芳香油類、生物堿類以及各種有機酸類等對細胞分裂、分化與伸長有重要阻礙作用的物質(zhì)，從而造成種子發(fā)芽的推遲或抑制[13]。Kentzer[14]和 Amen[15]認為抑制物質(zhì)的存在是植物種子休眠的主要原因之一。許多研究也表明，種子的果皮、種皮、胚乳和胚中存在某種化學成分，這些成分可能阻礙了植物生理的某個代謝環(huán)節(jié)，影響種子發(fā)芽進程從而導致種子休眠[16-17]。
植物種子中抑制物的種類和存在部位因植物的種類不同而不同，趙昕等[18]對結縷草(Zoysia japonica)種子進行研究，結果表明含有脫落酸等發(fā)芽抑制物質(zhì)影響種子發(fā)芽;張丹等[19]研究發(fā)現(xiàn)細葉鳶尾(Iris tenuifolia)種皮的甲醇浸提液具有抑制活性，說明種皮中存在萌發(fā)抑制物質(zhì);Wu 等[20]采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術鑒定了南京椴(Tilia miqueliana)果皮的化學成分，鑒定出酚類、酯類、有機酸、脂類、醛類以及不飽和脂肪酸等化合物，說明其可能在抑制萌發(fā)中發(fā)揮作用。本研究以新收獲的沙蘆草種子為材料，通過測定沙蘆草種子發(fā)芽抑制部位以及稃殼浸提液的生物活性，并利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)(QP-2010，日本)進一步測定有機化合物的種類，旨在為探明沙蘆草種子休眠機制與尋找種子休眠破除方法提供理論基礎。
1 材料與方法
1. 1 試驗材料供試沙蘆草種子為 2020 年鹽池四墩子試驗基地新收獲的種子。白菜(Brassica pekinensis)種子購于寧夏平羅縣寧源種業(yè)有限公司，純度≥95. 0%，發(fā)芽率≥90. 0%。
1. 2 試驗方法
1. 2. 1 沙蘆草種子發(fā)芽抑制部位試驗 試驗設 2 組處理，一組處理為人工去掉種子的內(nèi)外稃，另一組不做處理(CK)，每處理 5 個重復。發(fā)芽方法為：選取健康、大小一致的沙蘆草種子經(jīng) 0. 5% 的次氯酸鈉消毒 5 min，蒸餾水沖洗干凈，晾干種子表面水分后，均勻擺放在鋪有 2 層濾紙的直徑 90 mm 玻璃培養(yǎng)皿中，每皿 100 粒種子，培養(yǎng)皿中澆入約 6 mL 蒸餾水，使濾紙完全浸濕，放入 25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中光暗交替(12 h 光照/12 h 黑暗)培養(yǎng)。每天進行補水和發(fā)芽率統(tǒng)計。
1. 2. 2 沙蘆草種子抑制物確定試驗
1)甲醇相浸提液制備。稱取 24 g 的沙蘆草稃殼，用球磨儀(GT 200，北京)磨碎后，置于 50 mL 的離心管中，加入 25 mL 的 80% 的甲醇，在超聲波(600 w，40 kHz)中浸提 30 min，離心取上清液，連續(xù)浸提 3 次，將浸提的上清液合并一起，在 60 ℃恒溫水浴鍋中將甲醇粗提物揮發(fā)至干，然后用 100 mL蒸餾水溶解殘渣，得到 0. 24 g·mL-1的甲醇粗提母液，將粗提母液分別稀釋為 0. 20、0. 16、0. 12、0. 08、0. 04 g·mL-1的濃度，置于 4 ℃條件下保存?zhèn)溆肹16，21]。
2)不同濃度甲醇相浸提液生物活性測定。選取大小一致、顆粒飽滿的白菜種子，用蒸餾水沖洗后，每 100 粒白菜種子置于內(nèi)墊雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每 5 個培養(yǎng)皿為一組，共設 7 組。前 6 組白菜種子培養(yǎng)皿中分別加入濃度為 0. 24、0. 20、0. 16、0. 12、0. 08、0. 04 g·mL-1的甲醇粗提液 5 mL。第 7 組加入蒸餾水作為空白對照。將所有培養(yǎng)皿放在 25 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱(12 h 光照/12 h 黑暗)培養(yǎng)。統(tǒng)計白菜種子發(fā)芽率，并用游標卡尺測定白菜的根長、苗長。
3)不同相浸提液的制備。分別用石油醚、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和 H2O 進行沙蘆草稃殼浸提液制備。制備方法同甲醇相，得到 5 種不同相的沙蘆草稃殼浸提液，置于 4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?
4)不同相浸提液生物活性測定。根據(jù)甲醇相浸提液抑制白菜種子發(fā)芽確定的適合濃度，來制備甲醇、石油醚、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和 H2O 相浸提液的濃度進行白菜種子生物活性測定。
5)沙蘆草種子不同相浸提液化學成分分析。根據(jù)沙蘆草種子不同相浸提液對白菜發(fā)芽抑制試驗的結果，選取有明顯抑制活性的有機相浸提液，制備成濃縮樣品在寧夏大學測試分析中心用島津氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS-TQ8040)進行化學成分分析。氣相色譜條件為：載氣為氦氣，分流進樣，分流比 10∶1，柱流量 1. 0 mL·min-1。程序升溫從 60 ℃開始，保持 10 min，以 10 ℃·min-1的速率上升至 210 ℃，保持 10 min。進樣口溫度 250 ℃，離子源溫度 200 ℃，接口溫度 250 ℃，進樣量 1 μL。進樣結束后使用質(zhì)譜圖庫檢索與 Nist 2008 標準譜圖核對比檢測樣品中成分。檢測依據(jù) GB/T6041-2002，最后進行人工分析，以確定各組分物的化學結構和名稱。
1. 3 數(shù)據(jù)處理使用 Excel 2013 軟件進行基礎數(shù)據(jù)處理，DPS 2005 進行數(shù)據(jù)分析。
2 結果與分析
2. 1 沙蘆草種子發(fā)芽抑制部位
對照 CK 組沙蘆草種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率分別為 10. 80%、29. 20%，去稃處理組沙蘆草種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率分別為 49. 60%、63. 20%，去稃殼的沙蘆草種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率較對照組分別提高了 359. 26% 和116. 44%，去稃處理顯著提高了沙蘆草種子發(fā)芽勢及發(fā)芽率，說明沙蘆草種子發(fā)芽主要由稃殼抑制;去稃處理的沙蘆草胚根顯著長于對照 CK 組，但對沙蘆草胚芽的影響并不顯著，說明沙蘆草的稃殼對胚根的生長也產(chǎn)生一定的影響。
2. 2 不同濃度甲醇相浸提液的生物活性測定
隨著甲醇浸提液濃度的升高，白菜種子發(fā)芽率、根長及苗高均呈明顯降低趨勢，甲醇浸提液對白菜幼苗生長的抑制強度與濃度呈正相關。當浸提液濃度為 0. 08 g·mL-1 時，白菜種子的發(fā)芽率為76. 80 %，與對照 CK 相比降低了 18. 80%;當浸提液濃度達到 0. 16 g·mL-1時，其發(fā)芽率已降至 32. 80%，與對照組 CK 相 比 降 低 了 62. 80%;且 根 長 為 對 照 組 CK 的7. 69%，苗高為對照組 CK 的 50. 48%，0. 16 g·mL-1的浸提液濃度對白菜種子發(fā)芽率和生長有明顯的抑制，可作為制備其他有機相的浸提濃度。
2. 3 各相浸提液的生物活性測定
不同相浸提液均不同程度的抑制了白菜種子萌發(fā)，各相浸提液對白菜種子發(fā)芽率抑制作用均達到顯著水平，其中乙酸乙酯相對白菜種子發(fā)芽率抑制作用最大，與對照相比降低了 59. 33%，石油醚相的抑制作用最小，較對照降低了 8. 66%。
沙蘆草稃殼各相浸提液對白菜種子發(fā)芽率的抑制作用由大到小依次為：乙酸乙酯相>水相>甲醇相>丙酮相>乙醚相>石油醚相。水相對白菜根長及苗高的抑制作用最大，其根長和苗高僅為對照的 8. 54% 和 54. 68%;沙蘆草稃殼各相溶液對白菜根長的抑制作用由大到小依次為：水相>乙酸乙酯相>甲醇相>丙酮相>石油醚相>乙醚相;對白菜苗高的抑制作用由大到小依次為：水相>乙酸乙酯相>乙醚相>石油醚相>甲醇相>丙酮相，且各相溶液對白菜幼苗根長的抑制作用強于對苗高的影響。各相浸提液對白菜種子萌發(fā)存在抑制作用，其中水相對白菜生長的抑制作用最強。說明沙蘆草稃殼存在抑制種子萌發(fā)的物質(zhì)，且大部分都為水溶性的。
2. 4 沙蘆草稃殼各相浸提液提取的有機化合物種類及相對含量沙蘆草稃殼石油醚、乙醚、乙酸乙酯、甲醇和丙酮相提取物經(jīng) GC-MS 分析的離子流程，通過檢索質(zhì)譜系統(tǒng)與標準譜圖對比，篩選總離子流色譜圖中峰面積較大、相似度大于 85% 的有機化合物。
乙酸乙酯相中共檢測出 6 類，共 14 種有機化合物，其中，醇類有 6 種物質(zhì)，相對含量占 28. 04%;酮類有 1 種物質(zhì)(1，3-二氧戊環(huán)-4-酮)，相對含量為 19. 19%;烷類有 2 種物質(zhì)，相對含量為 18. 66%;酰胺類有 1 種物質(zhì)(己酰胺N-四氫糠基)，相對含量占 13. 16%;苯類有 2 種物質(zhì)，相對含量為 5. 22%;酯類物質(zhì)有 2 種，含量為 8. 36%。甲醇相中，共檢測出 15 種有機化合物共 5 類物質(zhì)，其中醇類有 5 種，相對含量為 30. 97%;酮類有 2 種物質(zhì)，相對含量占 23. 73%;烷類有 3 種物質(zhì)，相對含量為 17. 38%;酯類物質(zhì)包含 3 種，占總物質(zhì)的 14. 93%。
還有 2 種物質(zhì)為酰胺類，相對含量為 12. 99%。石油醚相中，共有 8 類物質(zhì)，其中縮醛類物質(zhì)含量最高，有 1 種縮醛物質(zhì)(N，N-二甲基甲酰胺乙縮醛)其含量為 38. 97%;其次為醇類物質(zhì)包含 4 種，相對含量為 22. 82%;烷類物質(zhì)有 2 種，共占總含量的 10. 00%;2 種酰胺類物質(zhì)，含量為 9. 44%;苯類物質(zhì)有 2 種，含量為 7. 44%;酯類物質(zhì)包含 2 種，含量為 4. 77%;其中酮類、酸類物質(zhì)各有一種，含量分別為 4. 39%、2. 17%。
乙醚相中，包含 7 類共 15 種有機化合物，含量最高的為醇類包括 4 種物質(zhì)，相對含量為 21. 83%;其次為酚類物質(zhì)有 2 種，分別為 2，6-二叔丁基對甲酚和 2，4-二叔丁基苯酚，相對含量分別為 5. 91% 和 20. 41%;烷類物質(zhì)包含 3 種，相對含量為 15. 90%;共有 1 種苯類物質(zhì)，占總物質(zhì)含量的 9. 32%;酯類物質(zhì)共有 3 種，占總物質(zhì)含量的9. 43%;酮類、酰胺類物質(zhì)各有一種，含量分別為 6. 90%、10. 30%。
丙酮相中，包含 15 種共 6 類物質(zhì)，其中酮類物質(zhì)含量最高共有 3 種，相對含量為 39. 37%;其次為醇類物質(zhì)共有 5 種，總相對含量為 21. 13%，烷類物質(zhì)包括 2 種，總相對含量為 14. 82%;酯類物質(zhì)共有 3 種，含量為 14. 58%;酰胺類和苯類各包含一種物質(zhì)，相對含量分別為 9. 57%、0. 53%。將各相篩選出離子流程圖中相似度大于 85% 的化合物整理，在 5 種有機相中共浸提出 32 種有機化合物，其中有 7 種物質(zhì)是相同的，分別是 1，1-二丁氧基丁烷、2，2'[- 1，4-丁二基雙(甲醛)]雙丁烷、2-甲基-3-己醇、4-丁氧基丁-1-醇、鄰苯二甲酸二乙酯、己酰胺 N-四氫糠基和 1，3-二氧戊環(huán)-4-酮。這 7 種物質(zhì)分別在各相中總抑制物質(zhì)的相對含量為石油醚相占 35. 20%、乙醚相占 52. 07%、乙酸乙酯相占 72. 99%、甲醇相占 50. 85%、丙酮相占47. 98%。說明這 7 種物質(zhì)可代表沙蘆草稃殼中的主要抑制物質(zhì)。
3 討論
休眠是指在合適的條件下，有活力的種子不能發(fā)芽的現(xiàn)象。種子休眠原因大致可分為種皮障礙類、胚與種子休眠及抑制物質(zhì)的存在。植物種子中存在的內(nèi)源抑制物質(zhì)是對種子休眠影響較大的因素之一，自然界大多數(shù)植物種子中都含有萌發(fā)抑制物[22]，并且抑制物質(zhì)分布廣泛。在植物果實與種子各部位均存在，不同部位中的抑制物質(zhì)其含量與種類也存在差異[23]。要確定內(nèi)源抑制物的存在，通常將種子各部位用甲醇、乙酸乙酯等有機溶劑浸提，并通過浸提液對白菜等非休眠植物種子進行發(fā)芽實驗，以此來判斷抑制物質(zhì)的存在[24]。
本研究對抑制沙蘆草種子發(fā)芽部位進行試驗，結果表明沙蘆草稃殼可顯著抑制其種子的發(fā)芽率，說明沙蘆草的稃殼中可能存在抑制物質(zhì)。朱銘瑋等[25]采用系統(tǒng)溶劑分離法對鳳丹(Paeonia ostii)種皮和種胚的浸提液進行分離，測定各提取相的生物活性，結果表明鳳丹種皮和種胚的乙醚相的抑制作用最強，判斷該種子乙醚相鑒定出的物質(zhì)可能與其生理休眠有密切關系。
劉序等[26]以白菜種子為指示植物，萃取出香榧(Torreya grandis)種子 3 個部位的內(nèi)源物，并對其進行了生物測定，結果表明其種子 3 個部位甲醇萃取液處理白菜種子無一粒發(fā)芽，抑制作用最強，其次為乙酸乙酯相;鄒雨婷等[16]分離出綠山楂(Crataegus pinnatifida)種子的石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相，并利用白菜籽發(fā)芽試驗對這 5 個相進行生物活性測定，結果表明各相對白菜種子的發(fā)芽均有一定的抑制作用，抑制作用最強的是乙醚相，其次是甲醇相。本試驗采用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、甲醇、丙酮及純水浸提沙蘆草稃殼，以白菜種子為受體材料對其進行生物活性的測定。
結果表明各浸提液對白菜種子發(fā)芽率、根長和苗高均有不同程度的抑制作用，而各相抑制作用表現(xiàn)存在差異的原因可能是各相中存在的萌發(fā)抑制物種類或含量有所不同[7]，其中水相浸提液對白菜種子萌發(fā)和生長的抑制作用最大，說明沙蘆草稃殼中大部分的抑制物質(zhì)為水溶性，其次是乙酸乙酯相、甲醇相，這與前人的結果基本一致。本研究通過各有機溶劑浸提沙蘆草稃殼，測定白菜種子的生長情況，結果表明沙蘆草種子稃殼浸提液對白菜幼苗根長的抑制作用強于對其苗高的影響，說明沙蘆草種子稃殼中的抑制物質(zhì)對幼苗地下部分的抑制作用更強，這與前人[17，27]的試驗結果一致。
抑制物質(zhì)是植物種子中存在的一些化學物質(zhì)，其參與并且影響某些與種子萌發(fā)有關的生理代謝活動[28]，當這種影響達到一定程度時即會導致植物種子萌發(fā)受到抑制。植物體內(nèi)的內(nèi)源抑制物質(zhì)種類復雜，約有 100 多種，如醛、酚、有機酸、內(nèi)酯等[29]，而常見的內(nèi)源抑制物質(zhì)有脫落酸、2，6-二叔丁基對甲酚、鄰苯二甲酸二丁酯、棕櫚酸等，其主要通過限制胚根生長和分化，誘導芽休眠，從而抑制種子萌發(fā)[30]。
許多學者對存在于植物種子中的發(fā)芽抑制物質(zhì)做了大量的研究，錢存夢[31]對烏桕(Sapium sebiferum)種子休眠的研究中證實了 2，6-二叔丁基對甲酚是重要的內(nèi)源抑制物。本試驗中，在乙醚相中也檢測出了 2，6-二叔丁基對甲酚和 2，4-二叔丁基苯酚，且酚類物質(zhì)占乙醚相檢測所有物質(zhì)的 26. 32%。蔡夢可[32]對花梨木(Dalbergia odorifera)類木材的耐腐性機理的研究中也發(fā)現(xiàn)了芥酸酰胺，認為其對真菌的活性有一定抑制作用。
本次試驗中各有機相均有酰胺類物質(zhì)的存在且含量較高，酰胺類物質(zhì)在石油醚相中的含量為 9. 44%、在乙醚相中的含量為 10. 30%、在乙酸乙酯相中的含量為 13. 16%、在甲醇相中的含量為 12. 99%，以及在丙酮相中的含量為 9. 57%，因此酰胺類物質(zhì)對沙蘆草種子萌發(fā)的影響需要深入研究。趙燕[17] 對滇重樓(Paris polyphylla var. yunnanensis)不同部位不同分離相 GC-MS 分析鑒定結果表明，滇重樓種皮與胚乳中存在多種有機化合物，主要為有機酸類、酯類、烷類、酚類等化合物。劉序等[26]對香榧種子的外種皮、內(nèi)種皮和胚乳的 GC-MS 檢測結果表明，有多種內(nèi)源物，主要物質(zhì)有烷類、酚類、醇類、酸類等。
本研究中，利用石油醚、乙醚、乙酸乙酯、甲醇和丙酮等有機溶劑浸提沙蘆草稃殼，并通過 GC-MS 分析檢測各相浸提液，結果表明 5 種有機相中共檢測到 32 種有機化合物，包含烷類、醇類、酯類、酮類、苯類、酰胺、縮醛、酸類和酚類等，其中含量最高的分別為醇類、酮類和烷類物質(zhì)，這與前人的研究結果大致相同。從以上檢測出的結果可知醇類、酮類和烷類可能是沙蘆草稃殼上抑制物質(zhì)的主要組成成分，也有可能是這幾種物質(zhì)相互作用從而導致沙蘆草種子的休眠。由于 GC-MS 分析技術只能確定某一物質(zhì)的相對含量，不能確定其實際含量，因此今后有必要繼續(xù)對造成沙蘆草稃殼休眠的抑制物的含量進行測定。
4 結論
沙蘆草種子發(fā)芽部位抑制試驗結果表明，去稃處理顯著提高了沙蘆草種子發(fā)芽勢及發(fā)芽率，說明沙蘆草種子發(fā)芽主要由稃殼抑制;各相浸提液的生物活性測定表明對白菜種子發(fā)芽率的抑制作用由大到小依次為：乙酸乙酯相>水相>甲醇相>丙酮相>乙醚相>石油醚相;通過 GC-MS 檢測，發(fā)現(xiàn)沙蘆草種子稃殼中存在烷類、醇類、酯類、酮類、苯類、酰胺、縮醛、酸類和酚類等 9 類 32 種有機化合物，其中醇類、酮類和烷類物質(zhì)的含量相對較高，且大部分為水溶性物質(zhì)，沙蘆草種子稃殼中存在的醇類、酮類和烷類等可溶性物質(zhì)是引起沙蘆草種子休眠的主要原因之一。
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作者：于金田 1，2，王晶 1，2，伏兵哲 1，2，高雪芹
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