摘要：中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品由于微生物的發(fā)酵作用改善產(chǎn)品的營養(yǎng)價值并賦予產(chǎn)品獨特的風(fēng)味，成為人們飲食中重要的組成部分。文章主要闡述了我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品常用的微生物檢測技術(shù)，并對中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物多樣性的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，旨在為篩選優(yōu)良發(fā)酵菌株，調(diào)控中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)酵過程提供理論參考。
關(guān)鍵詞：傳統(tǒng)發(fā)酵食品;測序方法;微生物多樣性;核心微生物
發(fā)酵是一種用于改善食品品質(zhì)和長期保存食品的加工手段[1]。傳統(tǒng)發(fā)酵食品通常憑借自然野生菌落發(fā)酵為主要生產(chǎn)方式。在進(jìn)行發(fā)酵時通常會引入來自于原料和環(huán)境的多種微生物，而這些微生物可利用原料中的營養(yǎng)成分通過三大代謝途徑———糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝改變食物本身的質(zhì)地及食用品質(zhì)，產(chǎn)生獨特的發(fā)酵香氣[2]。在我國幾千年的歷史進(jìn)程中，開發(fā)了原料多樣、工藝復(fù)雜、種類繁多的傳統(tǒng)發(fā)酵食品如發(fā)酵酒、酸菜、大醬、臘肉等，構(gòu)成了我國飲食文化重要的組成部分。由于在自然發(fā)酵的過程中微生物種類和豐度存在差異，而且常伴有有害菌或致病菌的引入，這會嚴(yán)重影響傳統(tǒng)發(fā)酵食品的感官品質(zhì)、風(fēng)味和食用安全性[3]。
因此，揭示傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物多樣性，探究菌群結(jié)構(gòu)和發(fā)酵過程中的核心微生物對科學(xué)安全地制作、調(diào)控發(fā)酵食品有著重要的指導(dǎo)作用，為傳統(tǒng)食品的發(fā)酵過程工業(yè)化、規(guī)?；?、穩(wěn)定安全化提供了理論基礎(chǔ)。本文重點綜述了現(xiàn)代高通量檢測方法，對中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物特殊的多樣性結(jié)構(gòu)和主要核心作用微生物、中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的前景導(dǎo)向進(jìn)行了展望，為傳統(tǒng)發(fā)酵食品的加工工藝改良和品質(zhì)調(diào)控提供了理論基礎(chǔ)。
1中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物多樣性研究方法
由于傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)方式所涉及到的微生物來源廣、種類多、演替演化規(guī)律復(fù)雜，僅單純依靠傳統(tǒng)人工分離方法不能滿足當(dāng)下人們對傳統(tǒng)發(fā)酵食品中復(fù)雜微生物系統(tǒng)的了解。近些年，隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，新一代測序技術(shù)正逐漸取代傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，廣泛應(yīng)用于微生物多樣性的分析。這些新一代測序技術(shù)一類是擴增子測序，例如一代測序：變性梯度凝膠電泳技術(shù)(PCR-DGGE);二代高通量測序：16SrDNA、ITS測序等;三代測序：16SrDNA全長、宏基因組技術(shù)，其優(yōu)勢在于可以對每一條獨立的DNA分子進(jìn)行測序，從而分析得到微生物的物種注釋及代謝通路信息。這些技術(shù)在發(fā)酵酒肉制品、谷物食品等鑒定中都有廣泛的應(yīng)用[4]。
1.1PCR-DGGE技術(shù)
傳統(tǒng)的平板分離培養(yǎng)方法過度依賴人工的操作及菌體的生長，實驗周期長，不確定性大。PCR-DGGE技術(shù)避開了傳統(tǒng)檢測方法的弊端，采用特異性PCR擴增從樣本中提取出來的基因組DNA，在DGGE技術(shù)有效分離和快速鑒定后將擴增產(chǎn)物進(jìn)行分析從而獲取到樣品中菌群圖譜[5]。燕平梅等利用PCR-DGGE技術(shù)在不同品種酸菜樣品中檢測到8種微生物，而散裝酸菜的微生物多樣性更為豐富，同時，在經(jīng)16SrDNA測定后，發(fā)現(xiàn)乳酸菌屬為酸菜中的核心微生物[6]。
與傳統(tǒng)的測序方法對比，PCR-DGGE技術(shù)在對傳統(tǒng)方法未能培養(yǎng)出來的菌株進(jìn)行鑒定時，用時更短，準(zhǔn)確度更高，并可對大量樣本同時進(jìn)行測序工作，是研究發(fā)酵食品微生物群落結(jié)構(gòu)最常用的分子生物技術(shù)之一[7]。但該技術(shù)具有一定的局限性，當(dāng)對復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行研究時，對豐度較低(低于1%)的微生物無法檢測出來[8]。
1.2高通量測序技術(shù)
高通量測序技術(shù)是基于高通量測序平臺檢測特定環(huán)境下的微生物，并結(jié)合生物與信息學(xué)來分析樣本中各種微生物物種種類、物種豐度、種群結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)演變等相關(guān)信息。根據(jù)細(xì)菌和真菌間的序列差異，高通量測序可以化分為16SrDNA、18SrDNA和ITS測序。16SrDNA主要進(jìn)行原核微生物的物種鑒定，而18SrDNA和ITS測序主要用于真核微生物的鑒定。
相比PCR-DGGE技術(shù)，高通量測序通過獲得大量測序結(jié)果數(shù)據(jù)，能夠?qū)ωS度低于0.0001%的痕量菌準(zhǔn)確檢出，從而系統(tǒng)完整地解析樣品中微生物菌相組成。李欣蔚等通過16SrDNA測序技術(shù)對自然發(fā)酵酸菜樣品中的多樣性組成進(jìn)行了分析，與PCR-DGGE技術(shù)測定結(jié)果相吻合，證實了高通量測序的準(zhǔn)確性[10]。在真菌鑒定方面主要有ITS測序技術(shù)和18SrDNA技術(shù)兩種，18SrDNA雖然能有效地鑒定出真核微生物的存在并進(jìn)行物種注釋，但其準(zhǔn)確度往往較低，在實際測序中常有部分真菌不能被分類。
ITS測序技術(shù)較18SrDNA技術(shù)測序的準(zhǔn)確度更高，對真菌微生物的鑒定能力更強。然而，高通量測序技術(shù)由于針對局部DNA區(qū)域的鑒定，因此，只能完成微生物屬水平鑒定。隨著三代測序的蓬勃發(fā)展，全長高通量序列測定可以彌補微生物在種水平鑒定上的空白。
曹碧璇等利用16SrDNA基因全長序列分析鑒定出自然發(fā)酵酸菜液樣品中有7個細(xì)菌菌屬及9個菌種，實現(xiàn)了微生物多樣性在種水平上的解析[11]。高通量測序是對傳統(tǒng)測序的革新式改變，也是目前最常見的測序方法，成本低廉，且令對發(fā)酵食品全部基因的深入分析成為可能。
1.3宏基因組技術(shù)
高通量測序技術(shù)促進(jìn)了組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相較于高通量測序，宏基因組基于對現(xiàn)代基因組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，其優(yōu)勢在于不僅可以準(zhǔn)確地對樣品進(jìn)行物種注釋，而且可以進(jìn)行功能注釋，挖掘部分微生物的功能基因?qū)ζ浯x途徑進(jìn)行預(yù)測，這為開發(fā)利用未知或未被培養(yǎng)的微生物、全面探究微生物基因功能性提供了研究基礎(chǔ)[12]。彭明芳等利用基因組技術(shù)對廣西酸菜進(jìn)行功能注釋，結(jié)果共注釋到17種在碳水化合物和氨基酸代謝與轉(zhuǎn)運功能上豐富的基因，如纖維素酶、果膠酶、淀粉水解酶和酯酶等，預(yù)測了微生物在酸菜發(fā)酵過程中可能發(fā)揮的作用[13]。
Guo等利用宏基因組技術(shù)在白酒窖泥中發(fā)現(xiàn)了乳酸菌、芽孢桿菌和梭菌等細(xì)菌與乳酸、乙酸等有機酸及乙醇、酯類等風(fēng)味化合物產(chǎn)生有關(guān)，而半乳酵母、青霉菌和曲霉菌等真菌微生物在白酒發(fā)酵中可以產(chǎn)生葡萄糖淀粉酶和α-淀粉酶，這對糖酵解過程影響顯著并可將淀粉等大分子物質(zhì)降解為小分子糖[14]，但宏基因組測序?qū)?shù)據(jù)處理核心技術(shù)的要求極高，當(dāng)樣本數(shù)量極大時，需要進(jìn)行多次測序，且宏基因組測序方法的定義和算法還不完善，是目前微生物學(xué)家面臨的一大難題。
目前對于研究發(fā)酵食品常用的測序方法如上所述，不同的方法各有特點，比如PCR-DGGE技術(shù)的高效快速，高通量測序技術(shù)的精準(zhǔn)分析，基因組技術(shù)的功能基因注釋。在實際的應(yīng)用選擇中，要結(jié)合樣品的狀態(tài)、測序的目的、預(yù)期的深度以及性價比進(jìn)行合理選擇。
2傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物多樣性及核心微生物研究進(jìn)展
近些年來，學(xué)者們對傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物多樣性展開了研究，產(chǎn)品主要涉及7大類，分別為發(fā)酵谷物類、豆類、乳類、蔬菜類、肉類、酸面團(tuán)類和其他。每一類都包含許多具有代表性的發(fā)酵食品。本部分內(nèi)容針對上述類別的中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性研究進(jìn)行了綜述。
2.1傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品
中國傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品主要分為兩類，分別是酸奶和奶酪，在新疆、內(nèi)蒙古、西藏等地有著深遠(yuǎn)的制作歷史。這些發(fā)酵乳制品的品質(zhì)往往因為地理環(huán)境因素以及人為因素而呈現(xiàn)出微生物菌群組成上的差異。中國傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的微生物組成復(fù)雜多樣，不同地域的微生物組成各有特點，通過對傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品微生物多樣性的解析，不僅可以更好地對其品質(zhì)進(jìn)行調(diào)控還對乳制品同質(zhì)化以及有效溯源體制的建立有著重要的指導(dǎo)意義。
2.2傳統(tǒng)發(fā)酵谷物制品
2.2.1發(fā)酵酒類制品
我國的酒文化歷史深遠(yuǎn)，釀酒工藝傳承了幾千年，其中在釀酒過程中，發(fā)酵是一個關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。中國發(fā)酵酒要經(jīng)過獨特而復(fù)雜的系統(tǒng)發(fā)酵，由于原料不同，酒曲不同及發(fā)酵工藝不同等，衍生出不同種類的發(fā)酵酒，其中最具代表性的是白酒、黃酒及米酒。大量研究發(fā)現(xiàn)不同酒曲的微生物菌群結(jié)構(gòu)差異較大，賦予了白酒和黃酒不同種香型，如清爽型、鳳香型、濃香型、芝麻香型等。
中國的傳統(tǒng)發(fā)酵酸面團(tuán)制品主要以饅頭為主，傳統(tǒng)饅頭的制作大多以酵子為發(fā)酵劑。研究發(fā)現(xiàn)，酵子的來源決定了其微生物組成。楊可等發(fā)現(xiàn)關(guān)中不同地區(qū)的饅頭酵子中優(yōu)勢菌屬均為乳酸菌屬，但不同地區(qū)的微生物組成差異較大。傳統(tǒng)酵子饅頭往往風(fēng)味之間存在差異，這也與酵子中微生物的組成和代謝有著密切聯(lián)系[47]。Suo等利用高通量測序方法研究了中國傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵的饅頭的微生物多樣性及風(fēng)味成分，結(jié)果顯示以乳酸桿菌和片球菌為主的優(yōu)勢菌屬在呈味方面發(fā)揮著重要的作用[48]。
馬凱等在對傳統(tǒng)酵子細(xì)菌多樣性的研究中進(jìn)一步確定了乳酸菌中以魏斯氏菌屬與乳酸乳桿菌屬為主的優(yōu)勢地位，并明確與商業(yè)酵母相比，醇類化合物的含量和種類是區(qū)分傳統(tǒng)酵子發(fā)酵饅頭與商業(yè)酵母的關(guān)鍵[49]。此外，學(xué)者們還對發(fā)酵茶如普洱茶、黑茶等[50-51]傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性進(jìn)行了研究，為提高產(chǎn)品加工效益和食用品質(zhì)提供了理論參考。
3展望
中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品種類多，微生物多樣性豐富，大多數(shù)仍停留在作坊式、家庭式的制作模式中，只有極少數(shù)發(fā)酵制品實現(xiàn)了工業(yè)化發(fā)展。這就使我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品存在工藝缺乏創(chuàng)新、制作周期冗長、安全穩(wěn)定性較差等原始問題，難以實現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。未來我們不僅需要全面了解傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的菌群結(jié)構(gòu)、關(guān)鍵微生物信息，還需要深入了解發(fā)酵過程中與風(fēng)味或品質(zhì)有關(guān)的功能性微生物的作用，對其發(fā)酵機理進(jìn)行挖掘，獲得發(fā)酵性能優(yōu)良的菌種，建立發(fā)酵食品菌種保藏庫，以期為人為調(diào)控中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品的發(fā)酵過程，使中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化、安全化生產(chǎn)。
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作者：陳鏡如，邊鑫，楊楊，邢童林，王子軒，任麗琨，胡良術(shù)，何林陽，張娜
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