摘 要：目的：探討環(huán)狀RNA(circRNA)＿0031269在宮頸癌組織及宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。方法：選取2017年1月至2019年12月深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院婦科收治的40例宮頸癌切除術(shù)后患者的腫瘤組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本為研究對(duì)象。采用實(shí)時(shí)熒光定量（RT-qPCR）檢測(cè)circRNA＿0031269在宮頸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平，以及在宮頸癌細(xì)胞Siha及Hela中的表達(dá)水平。結(jié)果：circRNA＿0031269在宮頸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織（P<0.05）;circRNA＿0031269在宮頸癌細(xì)胞Siha及Hela中的表達(dá)水平明顯高于人永生化表皮細(xì)胞HaCaT(P<0.05)。結(jié)論：circRNA＿0031269在宮頸癌組織和宮頸癌細(xì)胞（Siha、Hela）中的表達(dá)水平明顯升高。
關(guān)鍵詞: circRNA_ 0031269; 宮頸癌; Siha細(xì)胞; Hela細(xì)胞;
宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性健康。近年來(lái)，雖然宮頸癌的診斷和治療技術(shù)取得了很大的進(jìn)步，但宮頸癌的發(fā)病率及死亡率仍很高，特別是對(duì)于晚期宮頸癌患者，目前所有的治療方法效果均欠佳[1]。因此，研究宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的機(jī)制并尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)提高臨床診斷及治療具有十分重要的意義。環(huán)狀RNA(circular RNA,circ RNA）是一種具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的小分子非編碼RNA，廣泛分布于細(xì)胞內(nèi)。近10年來(lái)，已有大量的研究結(jié)果證實(shí)，circ RNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中具有重要的生物學(xué)作用[2]。然而，circ RNA調(diào)控宮頸癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制尚未完全闡明。本研究通過(guò)檢測(cè)circ RNA＿0031269在宮頸癌組織及宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，探討其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取2017年1月至2019年12月深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院婦科收治的40例宮頸癌切除術(shù)后患者的腫瘤組織標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本為研究對(duì)象。本研究經(jīng)深圳市前海蛇口自貿(mào)區(qū)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核，并且批準(zhǔn)實(shí)施，所有病歷資料征得患者同意，并已簽署知情同意書。
納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理組織學(xué)確診為宮頸癌。(2)所有宮頸癌患者均無(wú)放療或化療、免疫治療等抗腫瘤治療史。(3)術(shù)后隨訪資料完整。
排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在其他婦科疾病。(2)術(shù)前進(jìn)行過(guò)放療或服用過(guò)抗腫瘤藥。(3)兼具其他臟器的腫瘤患者。
1.2 主要試劑和儀器
宮頸癌細(xì)胞系（Siha、Hela）和人永生化表皮細(xì)胞Ha Ca T購(gòu)自美國(guó)ATCC（馬納薩斯，美國(guó)）；TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司（美國(guó)）；反轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購(gòu)自Ta Ka Ra公司（日本）；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、FBS試劑購(gòu)自Gibco公司（美國(guó)）；Nano Drop ND-2000分光光度計(jì)購(gòu)自Life Technologies公司（美國(guó)）；Light-Cycler-480 RT-PCR儀購(gòu)自Roche公司（瑞士）。
1.3 方法
1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代
宮頸癌細(xì)胞Siha、Hela均使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，所有細(xì)胞均在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱環(huán)境中培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)皿中細(xì)胞生長(zhǎng)密度為70%～80%時(shí)，即對(duì)細(xì)胞傳代。
1.3.2 總RNA提取和RT-q PCR
按照說(shuō)明書，使用TRIzol試劑從組織及對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞系中分別提取總RNA；利用分光光度計(jì)測(cè)量提取的組織及細(xì)胞的RNA純度；將純度合格的總RNA 500 ng進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并合成最后體積為10μL的c DNA。應(yīng)用的反轉(zhuǎn)錄體系為：2μL 5×Buffer,0.5μL RT Enzyme MixⅠ，0.5μL Oligo d T引物、隨機(jī)引物（100μmol/L），總RNA 500 ng，去離子水加至10μL。反應(yīng)條件為：37℃，15 min,85℃5 s,4℃，+∞。應(yīng)用的PCR反應(yīng)條件：95℃30 s后，95℃5 s和60℃20 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。所得數(shù)據(jù)通過(guò)公式2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算分析，內(nèi)參采用GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)量化。
表1 引物序列
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量（RT-q PCR）技術(shù)檢測(cè)circ RNA＿0031269在40例宮頸癌組織與癌旁組織，宮頸癌細(xì)胞Siha、Hela與人永生化表皮細(xì)胞Ha Ca T中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，circ RNA＿0031269在宮頸癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁組織（P<0.05），見(jiàn)圖1;circ RNA＿0031269在宮頸癌細(xì)胞Hela、Siha中的表達(dá)量明顯高于人永生化表皮細(xì)胞Ha Ca T(P<0.05），見(jiàn)圖2。
圖1?circ RNA＿0031269在癌旁組織及宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量
注：1)P<0.05。
圖2?circ RNA＿0031269在Ha Ca T、Hela、Siha細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量
注：1)P<0.05。
3 討論
circ RNA與micro RNA、lnc RNA同屬于非編碼RNA，與micro RNA、lnc RNA不同，circ RNA穩(wěn)定存在于真核生物細(xì)胞中，具有多種生物學(xué)作用，包括調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、micro RNA海綿吸附作用，甚至有翻譯蛋白質(zhì)功能[3]。目前，研究發(fā)現(xiàn)，circ RNA對(duì)包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要作用[4]。
circ RNA在許多類型的癌癥中高表達(dá)，如乳腺癌、肺癌和大腸癌[5,6,7]。幾種circ RNA在子宮頸癌組織以及衍生的細(xì)胞系中異常表達(dá)，并且主要通過(guò)吸附micro RNA來(lái)促進(jìn)腫瘤發(fā)生。有研究報(bào)道，由Clorf116基因編碼的hsa＿circ＿0141539(circ RNA-000284）被發(fā)現(xiàn)在子宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于鄰近的非腫瘤組織，并且與腫瘤的大小、FIGO分期以及子宮肌層浸潤(rùn)直接相關(guān)[8,9,10]。hsa＿circ＿0141539能夠使mi R-518d-5p/519-5p海綿化，從而導(dǎo)致靶基因CBX8的表達(dá)增加，并促進(jìn)子宮頸細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。此外，hsa＿circ＿0023404和VEGFA在宮頸腫瘤中被一致上調(diào)，而mi R-5047表達(dá)不足。
circ RNA＿0031269位于chr14:23495059-23504429，其基因長(zhǎng)度為9 370個(gè)堿基。目前，尚無(wú)關(guān)于circ RNA＿0031269與宮頸癌關(guān)系的報(bào)道。本研究明確了circ RNA＿0031269在宮頸癌組織中的表達(dá)量明顯高于癌旁組織（P<0.05),circ RNA＿0031269在宮頸癌細(xì)胞Siha、Hela中的表達(dá)量明顯高于人永生化表皮細(xì)胞Ha Ca T(P<0.05）。
目前，我們對(duì)circ RNA調(diào)控宮頸癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制的了解仍然很有限?，F(xiàn)階段大部分研究主要局限于circ RNA的micro RNA海綿吸附作用及其對(duì)下游靶基因的調(diào)節(jié)作用。對(duì)于circ RNA的其他功能，如circ RNA與RNA結(jié)合蛋白（RBP）的相互作用、circ RNA的蛋白質(zhì)翻譯功能、circ RNA的功能組學(xué)等方面研究較少，這些研究可為探索circ RNA調(diào)控腫瘤生物學(xué)功能提供更多思路，本研究仍需進(jìn)一步探索circ RNA＿0031269影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，隨著研究的不斷深入，circ RNA＿0031269調(diào)控宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制將會(huì)被闡明。
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文章名稱：circRNA＿0031269在宮頸癌組織及宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平
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