摘要： 目的探討肌動蛋白結(jié)合蛋白1（Abp1）對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）發(fā)育和功能的影響。方法流式細(xì)胞術(shù)檢測野生型小鼠（WT組）和Abp1基因敲除小鼠（KO組）胸腺、脾臟、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中T淋巴細(xì)胞和Treg細(xì)胞的比例、數(shù)量及相關(guān)性。功能分子的表達(dá)，體外抑制試驗(yàn)檢測Abp1缺失對Treg抑制功能的影響。結(jié)果與WT小鼠相比，Abp1 KO小鼠胸腺、脾臟、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中Tregs的比例和數(shù)量無明顯變化。同時，缺乏Abp1、ICOS、ICOS、CTLA4、PD-1和NRP-1表達(dá)的Treg細(xì)胞主要功能分子無顯著差異。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，與 WT 相比，缺乏 Abp1 的 Treg 細(xì)胞抑制了幼稚 T 細(xì)胞向活化 T 細(xì)胞的分化，而沒有顯著變化。結(jié)論 Abp1對Treg細(xì)胞的發(fā)育和功能無明顯影響。
關(guān)鍵詞： 肌動蛋白連接蛋白1; 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞; 抑制功能;
Abstract： This study was designed to investigate the effect of progranulin actin-binding protein 1(Abp1) on the differentiation and function of regulatory T cell,and the molecule mechanism.We detected the proportion,number and functional molecule expression of T lymphocytes and Treg cells in the thymus,spleen,peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes of wild-type mice(WT group) and Abp1 knockout mice(KO group) by cytometry flow,and the effect of Abp1 deletion on the inhibitory function of Treg in vitro was measured as well.Compared with WT mice,Abp1 KO mice had no significant differences on the proportion and number of Tregs in the thymus,spleen,peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes,meanwhile,the expression of the main functional molecules ICOS,CTLA4,PD-1 and NRP-1 in Treg cells lacking Abp1 were not significantly different.Furthermore,Abp1-absent Treg cells showed no significant changes in inhibiting T cells activation as comparing with WT Treg cells.In conclusion,Abp1 has no significant effect on the development and function of Treg cells.
Keyword： Actin-binding protein 1; Regulatory T cell; Suppressive function;
肌動蛋白結(jié)合蛋白1(actin-binding protein 1,Abp1）也稱為HIP-55或SH3P7，是一種由436個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量為48 600的肌動蛋白效應(yīng)蛋白。Abp1主要包含4個結(jié)構(gòu)域，包括N端肌動蛋白解聚因子同源區(qū)（ADF-H）、帶電荷的α-螺旋形結(jié)構(gòu)域（charged helix）、富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域（PRD）和C末端Src同源性3(SH3）結(jié)構(gòu)域[1],Abp1可通過ADF-H和charged helix可直接結(jié)合F-actin，在各種組織中廣泛表達(dá)[2,3,4]。
Abp1對Treg發(fā)育及功能的影響機(jī)制
早期的研究發(fā)現(xiàn)Abp1參與酵母細(xì)胞的增殖和生存[5]，在成纖維細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)Abp1可通過其SH3區(qū)域與GTP酶dynamin直接結(jié)合進(jìn)而參與細(xì)胞的內(nèi)吞[6]。在大腦皮層發(fā)育過程中Abp1可通過調(diào)控N-鈣黏附素的表達(dá)從而影響神經(jīng)元細(xì)胞的遷移、多極形態(tài)和細(xì)胞極性[7]，并且在神經(jīng)元突觸的形成和形態(tài)控制過程中也同樣發(fā)揮重要作用[8]。在癌細(xì)胞中增強(qiáng)Abp1的表達(dá)可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲，而抑制Abp1的表達(dá)則可逆轉(zhuǎn)這些作用[9,10]。但另有文獻(xiàn)報道，Abp1與FHL2(four and a half LIM domain protein2）的相互作用可抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲[11]。
同時，Abp1在淋巴細(xì)胞中也發(fā)揮重要作用。B細(xì)胞激活后BCR信號可誘導(dǎo)Abp1的磷酸化并促進(jìn)Abp1和與其結(jié)合的dynamin2向胞膜聚集，使其定位于細(xì)胞膜上的BCR與F-actin、dynamin2與細(xì)胞骨架的相互作用進(jìn)一步促進(jìn)了B細(xì)胞的抗原處理和遞呈[12]。缺失Abp1后不僅引起B(yǎng)CR介導(dǎo)的B細(xì)胞抗原遞呈功能受損，而且因Abp1缺失所致的肌動蛋白重塑異常致使與B細(xì)胞早期活化密切相關(guān)的BCR小體聚集及B細(xì)胞收縮亦受到顯著影響，導(dǎo)致缺失Abp1小鼠的邊緣區(qū)B細(xì)胞、生發(fā)中心B細(xì)胞的數(shù)量以及自身免疫抗體的水平顯著增加[13]。在T細(xì)胞中Abp1是TCR信號傳導(dǎo)的重要調(diào)節(jié)分子，通過將肌動蛋白、細(xì)胞骨架和內(nèi)吞作用[13]聯(lián)系起來共同調(diào)節(jié)T細(xì)胞的激活[14,15]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell,Treg）是一群具有免疫抑制功能的CD4+T細(xì)胞亞群，而Abp1對Treg功能的影響機(jī)制目前尚不清楚。
Treg是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)維持自身抗原耐受性和預(yù)防自身免疫性疾病的T細(xì)胞亞群。根據(jù)來源不同，Treg細(xì)胞可分為由胸腺分化的自然性Treg(natural Treg,n Treg）和主要存在于腫瘤組織和外周血中的誘導(dǎo)性Treg(induced Treg,i Treg），早期稱為抑制性T細(xì)胞[16]。Treg能夠抑制T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生，并且在預(yù)防自身免疫中起關(guān)鍵作用[17]。然而目前尚未建立起Abp1敲除小鼠模型來研究其對Treg發(fā)育及功能的影響。
本研究旨在探討Abp1對Treg的發(fā)育及功能的影響機(jī)制。因此，使用Abp1敲除小鼠來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析在Abp1缺失的情況下對Treg的發(fā)育和功能所產(chǎn)生的影響。
1、 材料與方法
1.1、 實(shí)驗(yàn)小鼠
本實(shí)驗(yàn)所用Abp1 KO小鼠為Balb/c背景，飼養(yǎng)在IVC環(huán)境中。所有的小鼠實(shí)驗(yàn)均遵循重慶醫(yī)科大學(xué)動物管理委員會和重慶醫(yī)科大學(xué)兒童醫(yī)院倫理委員會的規(guī)定。
1.2 、試劑和儀器
HBSS、1640培養(yǎng)基均購于Hyclone公司；胎牛血清購于Gibco公司；流式抗體以及染色劑分別購于BD、Biolegend、e Bioscience公司，分別為FITC-Annexin V、PE-ICOS(TE.17G9）、Percp/CY5.5-CD44(IM7）、Percp-7AAD(BBllife science）、APC-CD25(PC61）、APC/CY7-TCRβ（H57-597）、PE/CY7-CD62L(MEL-14）、PB-CD4(RM45）、BV510-CD8a(53-6.7）、FITC-FOXP3(FJ-16s）、PE-CTLA4(UC10-4B9）、PE/CY7-PD-1(RMP1-30）、PE-CD103(2E7）、APC-neuropilin(3E12）、PE-CY7-KI67、PE-CD4(GK1.5）、APC-IL-4(11B11）、BV421-IL-17(TC11-18H10.1）、PE/CY7-IFNγ（XMG1.2）；普通流式固定打孔劑購于美國BD公司；Foxp3固定打孔劑購于e Bioscience公司；PMA、離子霉素均購于美國Sigma公司；高爾基體阻斷劑購于BD Bioscience公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液Ficoll購于GE Healthcare公司。生物安全柜（Forma）、高壓滅菌鍋（Tomy ES-315）、超純水系統(tǒng)（Millipore）、流式細(xì)胞儀（BD）、臺式冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific）、室溫臺式離心機(jī)（Hettich Mikro）、細(xì)胞計數(shù)儀（Count star）。
1.3 、單個核細(xì)胞的制備
用CO2麻醉小鼠后將其斷頸處死，分別取出小鼠脾臟、胸腺、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)，在無菌條件下研磨，脾臟細(xì)胞懸液用3 ml的Ficoll進(jìn)行密度梯度離心，吸取單個核細(xì)胞層計數(shù)。
1.4 、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面分子
提取脾臟、胸腺、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)單個核細(xì)胞分別取1×106個單個核細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將抗體用不同濃度混于含有2%FBS的PBS緩沖液中。用50?l/孔配制的抗體稀釋液垂懸單個核細(xì)胞，冰上避光孵育30 min后用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，用200?l PBS緩沖液將細(xì)胞重懸后轉(zhuǎn)移至流式管中，上機(jī)。使用Flow JoTMV10軟件分析數(shù)據(jù)。
1.5 、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)分子
提取脾臟、胸腺、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)單個核細(xì)胞，分別取2×106個細(xì)胞于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用200?l細(xì)胞固定劑固定30 min，打孔劑洗滌1次后用打孔劑打孔5 min。將抗體用不同稀釋比例混于打孔劑。用50?l/孔配制的抗體稀釋液垂懸單個核細(xì)胞，冰上避光孵育30 min后用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，用200?l PBS緩沖液將細(xì)胞重懸轉(zhuǎn)移至流式管中，上機(jī)。使用Flow JoTMV10軟件分析數(shù)據(jù)。
1.6 、體外檢測Treg細(xì)胞抑制功能
提取WT及Abp1 KO小鼠脾臟單個核細(xì)胞，在無菌條件下使用鼠CD4/CD25陽性T細(xì)胞分選試劑盒（Miltenyibiotec,5190702555）分選出Treg細(xì)胞，使用小鼠初始CD4+T細(xì)胞分選試劑盒（Miltenyibiotec,5191209633）分選出初始T細(xì)胞。將使用Cell tracer(Technologies,1702579）標(biāo)記后的初始T細(xì)胞后與不同濃度的Treg細(xì)胞共培養(yǎng)于96孔板中，用1640+10%FBS培養(yǎng)基補(bǔ)足200?l，每孔加入1?l CD3/CD28-Beads(Gibco,11456D）刺激，在37℃的5%CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)72 h。72 h后收集細(xì)胞用流式細(xì)胞術(shù)檢測初始T細(xì)胞的增殖情況。使用Flow JoTMV10軟件分析數(shù)據(jù)。
1.7 、T細(xì)胞刺激后檢測胞內(nèi)細(xì)胞因子
配制刺激劑：1640培養(yǎng)基中加入胎牛血清（100?l/ml）、離子霉素（1?mol/L）、Golgi STOP(1∶1 000）、PMA(50 ng/ml）。提取脾臟、胸腺、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)單個核細(xì)胞，分別取2×106個細(xì)胞于24孔板中，每孔加入1 ml配制好的刺激劑垂懸后置于37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。5 h后收集細(xì)胞，將PB-CD4、BV510-CD8a、APC/CY7-TCRβ、Percp/CY5.5-CD444種抗體以不同稀釋比例混于2%FBS的PBS緩沖液中，然后取50?l/孔的抗體稀釋液重懸細(xì)胞進(jìn)行染色。冰上避光孵育30 min后用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞1次。然后，用200?l細(xì)胞固定劑固定30 min，打孔劑洗滌1次后用打孔劑打孔5 min。將APC-IL-4、PE/CY7-IFN-γ、BV421-IL-17 3種抗體用不同稀釋比例混于打孔劑中，并取50?l/孔配制的抗體稀釋液垂懸單個核細(xì)胞，冰上避光孵育30 min后用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，用200?l PBS緩沖液將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至流式管中，上機(jī)。使用Flow JoTMV10軟件分析數(shù)據(jù)。
1.8、 統(tǒng)計學(xué)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Graph Pad Prism 5統(tǒng)計軟件分析，組間差別采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 、結(jié)果
2.1、 Abp1敲除后對CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量的影響
為了研究Abp1敲除后對CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量的影響，我們使用流式細(xì)胞術(shù)對來自胸腺、脾臟、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)的單個核細(xì)胞進(jìn)行檢測。我們發(fā)現(xiàn)Abp1 KO鼠與野生型小鼠（WT）相比，CD4+和CD8+T細(xì)胞在脾臟、胸腺、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中細(xì)胞比例和數(shù)量差異均不明顯（圖1），這與文獻(xiàn)報道的Abp1缺失后對胸腺和脾臟中T細(xì)胞的影響結(jié)果一致[15]。由此我們可以推測，Abp1敲除后對T淋巴細(xì)胞中CD4+和CD8+的細(xì)胞比例和數(shù)量沒有顯著影響。
2.2、 Abp1敲除后對CD4+T淋巴細(xì)胞活化的影響
為了研究Abp1敲除后對CD4+T細(xì)胞中細(xì)胞活化的影響，我們使用多種抗體對來自脾臟、胸腺、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)單個核細(xì)胞進(jìn)行染色來區(qū)分CD4+T細(xì)胞的不同細(xì)胞亞群，并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測。我們發(fā)現(xiàn)Abp1 KO鼠與WT鼠相比，初始CD4+T細(xì)胞（CD44-CD62L+）與活化的CD4+T細(xì)胞（CD44+CD62L-）的比例和數(shù)量在脾臟、胸腺、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中均沒有明顯的差異（圖2）。由此我們認(rèn)為，Abp1敲除后對T淋巴細(xì)胞中CD4+細(xì)胞的活化影響不大。
2.3 、Abp1敲除后對CD8+T淋巴細(xì)胞活化的影響
為了進(jìn)一步研究Abp1敲除后對CD8+T細(xì)胞中細(xì)胞活化的影響，我們使用多種抗體對來自脾臟、胸腺、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)單個核細(xì)胞進(jìn)行染色來區(qū)分CD8+T細(xì)胞的不同細(xì)胞亞群，并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測。我們發(fā)現(xiàn)Abp1 KO鼠與WT鼠相比，幼稚的CD8+T細(xì)胞（CD44-CD62L+）與活化的CD8+T細(xì)胞（CD44+CD62L-）在脾臟、胸腺、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中均無明顯的差異（圖3）。因此可以推測，Abp1敲除后對T淋巴細(xì)胞中CD8+細(xì)胞的活化影響同樣較小。
2.4 、Abp1敲除后對Treg的影響
為了研究Abp1敲除后對Treg的影響，我們使用多種抗體對來自脾臟、胸腺、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)單個核細(xì)胞進(jìn)行染色，并用流式細(xì)胞術(shù)來檢查Treg的變化。分別使用CD4+CD25+和CD4+FOXP3+抗體來標(biāo)記Treg。我們發(fā)現(xiàn)在脾臟、胸腺、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中，無論是使用CD4+CD25+或使用CD4+FOXP3+標(biāo)記的Abp1 KO小鼠的Treg比例及細(xì)胞數(shù)與WT鼠相比變化均不大（圖4、圖5）。由此可以推測出Abp1的缺失對小鼠T細(xì)胞外周穩(wěn)態(tài)影響不大。
圖1 小鼠缺失Abp1對CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量的的影響
圖1 小鼠缺失Abp1對CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞數(shù)量的的影響
Fig 1 The effect of Abp1 deletion on the number of CD4+T cells and CD8+T cells in mice
a)Flow cytometry analysis of CD4+and CD8+T cells in thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes from wild type and Abp1 KO mice;b)the percentage of CD4+cells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4);c)the number of CD4+cells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4);d)the proportion of CD8+cells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4);e)the number of CD8+cells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4). 1 Abp1CD4+TCD8+T
2.5、 Abp1缺失對Treg功能的影響
為了進(jìn)一步確認(rèn)Abp1缺失對小鼠Treg功能分子的影響，我們使用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測了Treg細(xì)胞中誘導(dǎo)共刺激分子（inducible costimulatory,ICOS）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原（cytotoxic T lymphocyte associated antigen4,CTLA4）、程序性死亡分子1(programmed death-1,PD-1）和神經(jīng)纖維毛蛋白-1(neuropilin-1,NRP-1）的表達(dá)。其中，ICOS能夠穩(wěn)定表達(dá)在CD4+CD25+Treg細(xì)胞表面促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，CTLA4是表達(dá)于活化的CD4+和CD8+T細(xì)胞的表面分子，能夠下調(diào)或終止T細(xì)胞活化，PD-1表達(dá)于活化的T細(xì)胞并抑制T細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，NRP-1具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),ICOS、CTLA4、PD-1、NRP-1這4種功能分子在Abp1 KO小鼠的脾臟、胸腺、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)中的表達(dá)均沒有差異（圖6a～6d）。為了進(jìn)一步了解Abp1的缺失對Treg的抑制功能是否產(chǎn)生影響，我們將分選出的WT小鼠的初始T細(xì)胞同Abp1缺陷小鼠的Treg或野生型小鼠的Treg共培養(yǎng),并加入CD3/CD28刺激初始T細(xì)胞增殖,共培養(yǎng)3 d后檢測初始T細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果顯示W(wǎng)T小鼠組和KO小鼠組的初始T細(xì)胞增殖沒有明顯差異（圖6e）。這些結(jié)果表明Abp1對Treg的功能沒有明顯的影響。
圖2 小鼠缺失Abp1對CD4+T淋巴細(xì)胞的活化的影響
圖2 小鼠缺失Abp1對CD4+T淋巴細(xì)胞的活化的影響
Fig 2 The effect of Abp1 deletion on the activation of CD4+T lymphocyte in mice
a)Flow cytometry analysis of naive CD4+T cells and activated CD4+T cells in thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes from wild type and Abp1 KO mice;b)the proportion of naive CD4+T cells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4);c)the number of naive CD4+T cells in thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4);d)the proportion of activated CD4+T cells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4);e)the number of activated CD4+T cells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4).
2.6 、缺失Abp1的Treg對活化的CD4+T以及CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子能力的影響
為了進(jìn)一步了解缺失Abp1的Treg的對活化的CD4+T以及CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的能力的影響。我們使用PMA和離子霉素對Abp1 KO小鼠和WT小鼠的脾臟、胸腺、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)的單個核細(xì)胞進(jìn)行刺激，并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測刺激后的細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。我們分別檢測了CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生的γ-干擾素（IFN-γ）、白介素4(IL-4）和白介素17(IL-7）以及CD8+T細(xì)胞中的IFN-γ。IFN-γ參與介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，促進(jìn)Ig G的生產(chǎn)；IL-4促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的分化，主要介導(dǎo)體液免疫；IL-17參與固有免疫和炎癥的發(fā)生。結(jié)果顯示，KO小鼠的脾臟、胸腺、淺表淋巴結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、IL-4和IL-17以及CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ與WT鼠相比均沒有差異。（圖7）由此可知，缺失Abp1的Treg對活化的CD4+T以及CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力沒有顯著影響。
圖3 小鼠缺失Abp1對CD8+T淋巴細(xì)胞的活化的影響
圖3 小鼠缺失Abp1對CD8+T淋巴細(xì)胞的活化的影響
Fig 3 The effect of Abp1 deletion on the activation of CD8+T lymphocyte in Abp1 KO mice
a)Flow cytometry analysis of naive CD8+T and activated CD8+T cells in thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes from WT and Abp1 KO mice;b)the proportion of naive CD8+T cells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4);c)the number of naive CD8+T cells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4);d)the proportion of activated CD8+T cells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4);e)the number of activated CD8+T cells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4).
3、 討論
Abp1是一種能夠直接結(jié)合F-actin的肌動蛋白效應(yīng)蛋白，廣泛分布于各類細(xì)胞中。由于與肌動蛋白密切相關(guān)，Abp1不僅參與調(diào)控細(xì)胞的內(nèi)吞作用[6]，同時參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的伸展和遷移。有研究發(fā)現(xiàn)Abp1的缺失不僅影響小鼠白細(xì)胞的黏附，同時抑制白細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)散，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在b2整合素的刺激下Abp1主要聚集在極化的中性粒細(xì)胞前緣，同時增加了與肌動蛋白的結(jié)合從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞的遷移[18]。同時，Abp1對神經(jīng)元細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的遷移均有調(diào)控作用[7,11]。雖然有報道Abp1的缺失會導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)明顯的體質(zhì)量下降和較高的死亡率[15]，但是我們的Abp1小鼠模型在飼養(yǎng)過程中并沒有發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象。
圖4 Abp1的缺失對CD4+CD25+Treg細(xì)胞的影響
圖4 Abp1的缺失對CD4+CD25+Treg細(xì)胞的影響
Fig 4 The effect of Abp1 deletion on CD4+CD25+Treg cells
a)CD25 expression in thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes CD4+T cells from WT and Abp1 KO mice;b)theproportion of CD4+CD25+Tregs in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4);c)the number of CD4+CD25+Tregcells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4).
圖5 Abp1的缺失對CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞的影響
圖5 Abp1的缺失對CD4+Foxp3+Treg細(xì)胞的影響
Fig 5 The effect of Abp1 deletion on CD4+Foxp3+Treg cells
a)Foxp3 expression in thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes CD4+T cells of WT and Abp1 KO mice;b)theproportion of CD4+Foxp3+Tregs in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4);c)the number of CD4+Foxp3+Tregcells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4).
圖6 Abp1缺失對Treg功能的影響
圖6 Abp1缺失對Treg功能的影響
Fig 6 The effect of Abp1 deletion on the function of Treg
a) wild type and Abp1 KO mice (n=4);b)the mean fluorescence intensity of CTLA4 in CD4+Foxp3+Treg cells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4);c)the mean fluorescence intensity of PD-1 in CD4+Foxp3+Treg cells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4);d)the mean fluorescence intensity of NRP-1 in CD4+Foxp3+Treg cells in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes (n=4);e)naive T and Treg cells in spleen from WT and Abp1 KO mice were sorted separately, and the proliferation of naive T cells was detected by flow cytometry after co-cultivation in a certain proportion under CD3+CD28 stimulation for 3 days.
在T細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Abp1可通過抑制TCR信號對NFAT的激活以及下調(diào)TCR的表達(dá)對TCR信號進(jìn)行負(fù)向調(diào)控[14]。同時，T細(xì)胞的增殖亦受到Abp1的影響[15]。在活化的T細(xì)胞中，Abp1聚集于T細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞接觸的免疫突觸中[14]，亦有研究報道Abp1與F-actin在空間上的分離可抑制T細(xì)胞的運(yùn)動和活性，從而降低了T細(xì)胞浸潤以實(shí)現(xiàn)異源嵌合分子的免疫抑制活性[19]。這些研究說明Abp1對于T細(xì)胞的遷移有顯著的影響。Treg細(xì)胞是一群主要在胸腺發(fā)育具有免疫抑制作用的T細(xì)胞亞群，其在胸腺發(fā)育成熟后遷移到外周各淋巴器官發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用，因此，我們猜測Abp1有可能調(diào)控Treg從胸腺至外周的遷移。然而通過流式細(xì)胞術(shù)對胸腺、脾臟、皮下淋巴結(jié)以及腸系膜淋巴結(jié)的Treg進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，Abp1缺失小鼠的Treg細(xì)胞在胸腺及外周淋巴器官內(nèi)的Treg比例和數(shù)量與野生型小鼠相比沒有明顯差異，說明Abp1的缺失對于Treg的外周遷移并沒有明顯的影響，提示Abp1雖然是結(jié)合F-actin的效應(yīng)分子，與肌動蛋白重組有密切關(guān)系，然而肌動蛋白重組對于Treg的遷移可能主要通過其他分子進(jìn)行調(diào)控，Abp1通過肌動蛋白重組對Treg外周遷移的影響可能被其他肌動蛋白調(diào)節(jié)相關(guān)分子的調(diào)節(jié)所代償。已有報道，在生長因子的刺激下，Abp1主要聚集在F-actin富集的遷移細(xì)胞的前緣，并且主要定位于Arp2/3復(fù)合物處[3]，而Abp1又能夠與WIP通過其SH3區(qū)域直接結(jié)合[1]，在淋巴細(xì)胞中，WIP和另一重要肌動蛋白調(diào)控分子WASP亦可通過Arp2/3調(diào)控肌動蛋白重組，并且已報道WASP對于Treg的遷移和歸巢具有顯著影響[20]，因此我們猜測，Abp1對于Treg的影響有可能受到WIP和WASP的補(bǔ)償。
圖7 缺失Abp1的小鼠Treg對活化的CD4+T以及CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的影響
圖7 缺失Abp1的小鼠Treg對活化的CD4+T以及CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的影響
Fig 7 The effect of Treg from Abp1 KO mice on the ability of active CD4+T and CD8+T cells to produce cytokines
a)IFN-γ, IL-4 and IL-17 production in thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes CD4+T cells from WT and Abp1 KOmice. IFN-γin thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes CD8+T cells;b)the proportion of IFN-γin the thymus, spleen,peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes CD4+T cells (n=4);c)the proportion of IL-4 in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes andmesenteric lymph nodes CD4+T cells(n=4);d)the proportion of IL-17 in the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes CD4+Tcells (n=4);e)the proportion of IFN-γin the thymus, spleen, peripheral lymph nodes and mesenteric lymph nodes CD8+T cells (n=4).7 Abp1TregCD4+TCD8+T
另外，IL-2是調(diào)控Treg的分化和功能重要的細(xì)胞因子，IL-2能夠促進(jìn)Treg的發(fā)育、生存以及對T細(xì)胞的抑制功能[21]。有研究報道Abp1缺失的小鼠T細(xì)胞分泌的IL-2含量明顯減少[15]，因此我們使用體外抑制試驗(yàn)檢測缺失Abp1的Treg的抑制功能是否受到影響，結(jié)果同樣顯示Treg的功能在缺失Abp1的情況下沒有顯著的變化，這與我們檢測到胸腺及各外周淋巴器官中幼稚CD4與活化CD4的比例變化以及Treg表面功能分子的表達(dá)未有明顯改變相一致。說明Abp1導(dǎo)致的IL2改變并不能影響Treg的抑制功能。
總之，雖然Abp1是調(diào)控肌動蛋白重要的效應(yīng)分子，并且可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的遷移以及淋巴細(xì)胞的信號，然而Abp1對于Treg的遷移及功能的影響是有限的。
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文章名稱：Abp1對Treg發(fā)育的影響
