摘 要：目的 增生性瘢痕是一種真皮纖維增生性疾病。A型肉毒毒素具有預(yù)防增生性瘢痕形成的作用，但其抗皮膚纖維化的作用及其機(jī)制尚不清楚。本研究分析A型肉毒毒素(BTXA)對(duì)增生性瘢痕(HS)JNK信號(hào)通路和成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法 本研究采用0、1、2、4U/ml BTXA對(duì)人瘢痕成纖維細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)CCK8劃痕法、熒光定量PCR和western印跡法檢測(cè)不同濃度BTXA對(duì)HS成纖維細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞凋亡和蛋白表達(dá)的變化。并對(duì)比BTXA干預(yù)前后轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、α-肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號(hào)通路、磷酸化氨基末端激酶(p-JNK)等成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果 與無(wú)BTXA干預(yù)相比，1、2、4U/ml BTXA干預(yù)后HS成纖維細(xì)胞增殖能力較低(P<0.05)；與無(wú)BTXA干預(yù)相比，1、2、4U/ml BTXA干預(yù)后HS成纖維細(xì)胞凋亡率增高(P<0.05)；與BTXA干預(yù)前相比，BTXA干預(yù)后TGF-β1、α-SMA、CTGF等基因水平和蛋白水平均降低(P<0.05)；與JNK選擇性抑制SP600125干預(yù)前相比，JNK選擇性抑制SP600125干預(yù)后p-JNK表達(dá)較高(P<0.05)。結(jié)論 BTXA可影響HS患者成纖維細(xì)胞增殖、遷移和凋亡，并能通過(guò)JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡，調(diào)控其相關(guān)蛋白表達(dá)，為臨床治療提供新靶點(diǎn)。 關(guān)鍵詞：增生性瘢痕; A型肉毒毒素; JNK信號(hào)通路;成纖維細(xì)胞蛋白;細(xì)胞增生周期;細(xì)胞凋亡率; 作者簡(jiǎn)介：郭彩茹(1982-)，主管技師，碩士研究生;*李明鳴，E-mail:lyszxyylmm@163.com; 增生性瘢痕(Hypertrophic scar，HS)為纖維變性疾病，由創(chuàng)傷、燒傷等損傷真皮深層后纖維增殖紊亂所致[1,2]。相關(guān)數(shù)據(jù)報(bào)道，燒傷后HS發(fā)生率高達(dá)91%，手術(shù)后HS發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)為40%～70%[3,4]。HS疼痛、瘙癢等癥狀極大影響日常生活，且嚴(yán)重者會(huì)并發(fā)局部潰爛或癌變，為患者帶來(lái)極大肉體損害、精神痛苦。有相關(guān)研究成纖維細(xì)胞為HS患者瘢痕形成的重要效應(yīng)細(xì)胞，A型肉毒毒素(Botulinum toxin A，BTXA)可抑制、治療瘢痕增生[5]。進(jìn)一步探討B(tài)TXA的作用機(jī)制，觀察BTXA對(duì)成纖維細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信號(hào)變化的影響，分析BTXA對(duì)HS成纖維細(xì)胞增殖、凋亡的機(jī)制，可為HS患者的臨床生物學(xué)治療提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)?；诖耍狙芯窟x取人成纖維細(xì)胞，探討B(tài)TXA對(duì)HS成纖維細(xì)胞的抑制作用和分子機(jī)制。報(bào)告如下。 1 資料與方法 1.1 一般資料 本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過(guò)，選取2021年10月我院HS患者手術(shù)標(biāo)本，經(jīng)病理組織學(xué)確診為HS；存在瘢痕凸出皮膚表面，癢、紅、痛等癥狀，處于增生活躍期；患者知情本研究并簽署知情承諾書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：取材前應(yīng)用過(guò)青霉胺、類(lèi)固醇激素等相關(guān)藥物；取材前有放射線(xiàn)治療史者；取材前有激光治療史者；合并感染性疾病者。 1.2 材料與方法 1.2.1 HS成纖維細(xì)胞制備 將手術(shù)過(guò)程中獲得的組織標(biāo)本置于無(wú)菌操作臺(tái)，使用手術(shù)剪去除皮下組織，保留帶表皮的瘢痕組織，將瘢痕組織剪成規(guī)格為1mm×1mm小組織塊，使用磷酸鹽緩沖液沖洗干凈，加入3倍體積1mg/ml的Ⅰ型膠原酶，37℃條件下振蕩水浴40-60min，加入3倍體積完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基)終止消化，1500r/min，離心5min后棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，80um無(wú)菌濾網(wǎng)過(guò)濾，將無(wú)菌濾液加入培養(yǎng)瓶中放37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，4d后換液，后每間隔3d換液1次，約15d細(xì)胞基本融合，依據(jù)1：3比例傳代，培養(yǎng)3代后進(jìn)行試驗(yàn)。 1.2.2 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml，接種至96孔版，100ul/孔，細(xì)胞貼壁后，分別加入濃度為0、1、2U、4U/ml BTXA，100ul/孔每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞鋪板后2h，每孔加10μL CCK8試劑，3小時(shí)后酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定各組光密度(OD)值。每隔24小時(shí)按以上方法測(cè)一次OD值，繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。 1.2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整密度為0.5×106/ml個(gè)，種植于6孔板中，每孔2ml。待細(xì)胞貼壁后，去除培養(yǎng)基，分別加入濃度為0、1、2U、4U/ml BTXA的完全培養(yǎng)基，2ml/孔，細(xì)胞貼壁后用消毒 1000μL移液槍頭均勻劃1條線(xiàn)，用 PBS洗細(xì)胞2次，去除漂浮細(xì)胞，顯微鏡下拍照記為0h，放于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取24h，48h時(shí)間點(diǎn)于倒置顯微鏡下拍照，計(jì)算細(xì)胞遷移率。 1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml，1ml/孔，接種至24孔版，培養(yǎng)24h后去除培養(yǎng)基，分別加入濃度為0、1、2、4U/ml BTXA的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h，參照活細(xì)胞Caspase-3活性與Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)操作，染色、固定，于顯微鏡下觀察。 1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)成纖維相關(guān)蛋白基因變化 按照1.2.3方法進(jìn)行藥物干預(yù)48小時(shí)后，消化細(xì)胞，使用Trizol(碧云天)從成纖維細(xì)胞中提取總RNA，測(cè)總RNA濃度。使用天根FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑逆轉(zhuǎn)錄cDNA(KR118)，使用天根SuperReal PreMix Plus (SYBR Green，F(xiàn)P205)試劑，使用ABI StepOnePlus Real-Time PCR進(jìn)行熒光定量PCR。引物合成自生工生物公司。引物序列：(1) CTGF：F:CTTGCGAAGCT GACCTGGAA,R:AAAGCTCAAACTTGATAGGCTTGGA(2)TGF1:F:GTACCTGAACCCGTGTTGCT,R:GAACCCGTTGATGTCCACTT (3)α-SMA:F:CTGCTGAGCGTGAGATTGTC,R:CTCAAGGGAG GATGAG GATG (4)JNK:F:GCTGGAATTATTCATCGGGAC、R:GATGA CCTCGGGTGCTCTG,(5)GAPDH:F:TGACTTCAACAGCGACACCCA-3 R:GGAGGAGT GGGTGTCGC TGT 1.2.6 運(yùn)用Western blot法檢測(cè)BTXA干預(yù)前后HS成纖維細(xì)胞中CTGF、α-SMA、TGF-β1、JNK的蛋白表達(dá) 在HS成纖維細(xì)胞中加入JNK選擇性抑制劑SP600125，運(yùn)用Western blot法檢測(cè)BTXA干預(yù)前后p-JNK的蛋白水平。簡(jiǎn)要如下HS成纖維細(xì)胞，按照1.2.3描述的方法處理后，收取細(xì)胞后使用含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、PMSF的 RIPA高效細(xì)胞/組織裂解液(索萊寶)提取蛋白，并根據(jù) BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度。待測(cè)蛋白用10%的SDS-PAGE凝膠電泳(60～80V)，然后將目的蛋白在300mA 、90min的條件下轉(zhuǎn)移至PVDF膜(PVDF，Millipore)。TBST溶液洗膜5min×3次；5%脫脂牛奶室溫封閉1h；一抗(1∶1 000稀釋)、 GAPDH(1∶1 000稀釋)4℃孵育過(guò)夜后再用兔二抗(1∶1000稀釋)室溫孵育1 h。使用 BeyoECL plus 發(fā)光液(碧云天)發(fā)光并拍攝。 1.3 觀察指標(biāo) ①BTXA對(duì)HS成纖維細(xì)胞增殖能力的影響，對(duì)比無(wú)BTXA干預(yù)和1、2、4U/ml BTXA干預(yù)后成纖維細(xì)胞增殖活力變化。③BTXA對(duì)HS成纖維細(xì)胞凋亡率的影響，對(duì)比無(wú)BTXA干預(yù)和1、2、4U/mlU/ml BTXA干預(yù)后成纖維細(xì)胞凋亡率。④成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)，對(duì)比BTXA干預(yù)前后TGF-β1CTGF、α-SMA、JNK表達(dá)。⑤JNK信號(hào)通路，對(duì)比JNK選擇性抑制SP600125干預(yù)前后磷酸化氨基末端激酶(p-JNK)表達(dá)。 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料正態(tài)分布以()表示，組間比較行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 2 結(jié) 果 2.1 BTXA對(duì)HS成纖維細(xì)胞活力的影響 CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與無(wú)BTXA干預(yù)相比，1、2 、4U/ml BTXA干預(yù)后48h，72h HS成纖維細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。 圖1 BTXA對(duì)HS成纖維細(xì)胞增殖的影響 2.2 BTXA對(duì)HS成纖維細(xì)胞遷移的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與無(wú)BTXA干預(yù)相比，2U/ml、4U/ml BTXA干預(yù)后成纖維細(xì)胞遷移能力降低，劃痕愈合減慢（P<0.05）。見(jiàn)圖2。 圖2 BTXA對(duì)HS成纖維細(xì)胞遷移的影響（×100) 2.3 BTXA對(duì)HS成纖維細(xì)胞凋亡率的影響 與無(wú)BTXA干預(yù)相比，2U/ml，4U/ml BTXA干預(yù)后HS成纖維細(xì)胞凋亡率增高(P<0.05)，紅色、綠色表示凋亡細(xì)胞，見(jiàn)圖3。 圖3 BTXA對(duì)HS成纖維細(xì)胞凋亡率的影響（×50) 2.4 成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白基因表達(dá) 熒光定量PCR結(jié)果表明，與BTXA干預(yù)前相比，BTXA干預(yù)后TGF-β1、α-SMA、CTGF基因表達(dá)均較低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。 圖4 成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白基因表達(dá) 2.5 成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) 與BTXA干預(yù)前相比，BTXA干預(yù)后TGF-β1表達(dá)較低(P<0.05)。見(jiàn)圖5 圖5 成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá) 2.6 JNK信號(hào)通路 與JNK選擇性抑制SP600125干預(yù)前相比，JNK選擇性抑制SP600125干預(yù)后p-JNK表達(dá)較高(P<0.05)。見(jiàn)表1。 表1 JNK信號(hào)通路 3 討 論 HS為病理性瘢痕，在創(chuàng)傷6個(gè)月時(shí)增長(zhǎng)速度，可發(fā)生在全身各個(gè)部位，HS組織學(xué)多表現(xiàn)為豐富纖維細(xì)胞、酸性粘多糖和排列規(guī)則Ⅲ型膠原，基底部多局限于原始損傷界限內(nèi)，痛癢感明顯[6,7]。目前，臨床針對(duì)HS發(fā)生機(jī)制尚未做出全部闡述，但既往有研究報(bào)道HS發(fā)生與基因調(diào)控、細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、信號(hào)因子等相關(guān)，多因素共同作用調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、代謝、凋亡[8,9]。 成纖維細(xì)胞無(wú)法進(jìn)入正常程序性死亡，會(huì)致使其異常增殖且細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積，在創(chuàng)傷修復(fù)晚期，依靠細(xì)胞凋亡組織改建，可改善凋亡機(jī)制，抑制HS形成。肉毒素為肉毒桿菌增殖過(guò)程中產(chǎn)生的細(xì)菌外毒素，依照肉毒素抗原性不同，可分為A、B、C1、C2、D、E、F、G八個(gè)類(lèi)型，A型毒力最強(qiáng)[10,11,12]。BTXA為二硫鍵結(jié)合的重鏈和輕鏈組成的多肽鏈，能被蛋白酶裂解，可阻斷神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)，抑制神經(jīng)傳遞介質(zhì)，能抑制膠原分泌，延緩成纖維細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13,14,15]。研究結(jié)果表明，與無(wú)BTXA干預(yù)相比，1、2、4U/ml BTXA干預(yù)后HS成纖維細(xì)胞增殖能力較低、HS成纖維細(xì)胞凋亡率增高(P<0.05)。近年來(lái)，臨床關(guān)于BTXA治療HS的研究主要集中在TGF-β1上，TGF-β1為HS發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中重要促纖維化細(xì)胞因子，其高表達(dá)可激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，調(diào)控JNK信號(hào)通路，將細(xì)胞外刺激信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，激活相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)，參與瘢痕增生[16,17]。α-SMA是肌成纖維細(xì)胞特征性標(biāo)志物，是瘢痕組織具有收縮活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，可反映成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化受影響情況。CTGF是一種分子量為36～38kDa的多肽，在成纖維細(xì)胞中主要由TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生，CTGF過(guò)度激活是纖維化疾病發(fā)生和HS發(fā)生進(jìn)展的重要影響因素。與BTXA干預(yù)前相比，BTXA干預(yù)后TGF-β1、α-SMA、CTGF等基因水平和蛋白水平均降低(P<0.05)，表明BTXA可調(diào)控JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白基因和蛋白表達(dá)。此外，研究結(jié)果還顯示，與JNK選擇性抑制SP600125干預(yù)前相比，JNK選擇性抑制SP600125干預(yù)后p-JNK表達(dá)較高(P<0.05)。JNK屬于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)亞族，BTXA可依靠MAPK途徑調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)增生，抑制信號(hào)傳導(dǎo)和MAPK介導(dǎo)的細(xì)胞系列反應(yīng)，阻礙細(xì)胞生物學(xué)功能，抑制HS形成。同時(shí)BTXA能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)不同蛋白比值，調(diào)整細(xì)胞增殖基因表達(dá)，影響相關(guān)DNA合成，發(fā)揮抑制瘢痕形成作用。 綜上所述，BTXA可影響HS患者成纖維細(xì)胞增殖、遷移和凋亡，并能通過(guò)JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡，調(diào)控其相關(guān)蛋白表達(dá)，為臨床治療提供新靶點(diǎn)。本研究只初步探討了BTXA對(duì)HS患者JNK信號(hào)通路和成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，但瘢痕形成主要有炎癥期、纖維增生期、組織重建期，不同時(shí)期成纖維細(xì)胞活躍度存在差異，關(guān)于BTXA對(duì)不同時(shí)期HS形成的影響，有待日后進(jìn)一步深入研究。 本文由期刊論文網(wǎng)首發(fā)，一個(gè)權(quán)威專(zhuān)業(yè)的學(xué)術(shù)論文發(fā)表知識(shí)網(wǎng)。 文章名稱(chēng)：A型肉毒毒素對(duì)增生性瘢痕JNK信號(hào)通路和成纖維細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響