摘 要:目的 了解2017—2018年大連市兩種不同來源的副溶血性弧菌主要毒力基因的分布差異。方法 對(duì)2017—2018年大連市食品和患者兩種來源共160株副溶血性弧菌用VITEK 2 compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定,并檢測(cè)不耐熱溶血素基因(tlh)、耐熱直接溶血素基因(tdh)、耐熱相關(guān)溶血素基因(trh)、toxRS/new、orf8及Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS1、T3SS2α、T3SS2β)。結(jié)果 160株副溶血性弧菌經(jīng)系統(tǒng)生化鑒定全部為副溶血性弧菌。兩種來源菌株tlh、T3SS1攜帶率均為100%,trh攜帶率為0,攜帶率無差異;食品來源菌株的毒力基因T3SS2β攜帶率(1.20%)略高于患者來源菌株(0),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.934,P>0.05);食品來源菌株的toxRS/new攜帶率(10.84%)明顯高于患者來源菌株(2.60%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.242,P<0.05);食品來源菌株的tdh、orf8、T3SS2α的攜帶率(分別為8.43%、3.61%、19.28%)明顯低于患者來源的菌株(分別為70.13%、25.97%、88.31%),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=64.452、16.224、76.336,均P<0.05);食品來源菌株tdh-/trh-/orf8-/T3SS2α-/T3SS2β-比例(68.67%)明顯高于患者來源菌株(6.49%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=65.071,P<0.05);兩種來源的菌株均不存在同時(shí)攜帶tdh/toxRS/new的菌株。結(jié)論 2017—2018年大連市食品和患者兩種來源的菌株均不存在大流行菌株,都攜帶tlh和T3SS1,不攜帶trh;除toxRS/new外,食品來源的副溶血性弧菌毒力基因攜帶率明顯低于患者來源的菌株。
關(guān)鍵詞:大連 副溶血性弧菌毒力基因
副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性弧菌,屬于弧菌科、弧菌屬,存在于近海海水及海產(chǎn)品中。除外傷引起的傷口感染及敗血癥,副溶血性弧菌最常見的是引起急性胃腸炎,其原因通常是人們生食或食用未充分煮熟的海產(chǎn)品。有研究顯示,不同來源的副溶血性弧菌攜帶毒力基因差異較大,大部分環(huán)境分離株(包括食品分離株)缺少毒力基因[1],不能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹瀉,而臨床分離株則能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腹瀉[2];不同地區(qū)流行的副溶血性弧菌攜帶的毒力基因也有很大差別[3]。我們檢測(cè)2017—2018年大連市食品和患者兩種來源的副溶血性弧菌毒力基因,包括不耐熱溶血素基因(tlh)、耐熱直接溶血素基因(tdh)、耐熱相關(guān)溶血素基因(trh)、toxRS/new、orf8及Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS1、T3SS2α、T3SS2β),分析兩種來源菌株攜帶毒力基因的差異。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株
收集2017和2018年大連市食品和患者來源的副溶血性弧菌共160株,其中食品來源菌株83株,主要是食品風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和食物中毒事件中從食品分離的菌株;患者來源菌株77株,主要是大連市食源性致病菌主動(dòng)監(jiān)測(cè)和食物中毒事件中從患者糞便分離的菌株。
1.1.2 主要的試劑與培養(yǎng)基
胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptose Soya Agar,TSA)(北京陸橋技術(shù)股份有限公司,Lot No.180705),vitek2革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定卡(法國梅里埃,Lot No.2410915403),Taq酶(日本寶生物,Lot No.RR001A),引物由華大基因合成。
1.1.3 主要的設(shè)備
全自動(dòng)細(xì)菌鑒定和藥敏分析系統(tǒng)(法國梅里埃,VITEK2 Compact),PCR儀(美國伯樂,C1000 Touch Thermal cycler),毛細(xì)管電泳儀(美國凱杰,Qiaxcel)。
1.2 方法
1.2.1 生化鑒定復(fù)核
將待復(fù)核菌株接種至含3%氯化鈉TSA,37℃培養(yǎng)24 h,復(fù)蘇后用VITEK2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定。
1.2.2 毒力基因檢測(cè)
用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)方法檢測(cè)毒力基因:tlh、tdh、trh、toxRS/new、orf8、T3SS1、T3SS2α及T3SS2β。核酸提取:菌株復(fù)蘇后,接種于含3%氯化鈉TSA平板,37℃培養(yǎng)24 h后,挑取單個(gè)菌落于200μL滅菌水中充分研磨,10 000 r/min、離心半徑13.5 cm、離心5 min,棄去上清液,加入100μL裂解液99℃金屬浴10 min,10 000 r/min離心5 min,上清即為DNA。PCR反應(yīng)體系25μL,10×PCR緩沖液2.5μL,Taq DNA聚合酶0.25μL,脫氧核糖核酸(dNTP)2μL,引物(10μMol/L)各1μL,DNA模板1μL,加無酶H2O補(bǔ)充至25μL。tlh/tdh/trh按照國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心提供的引物序列進(jìn)行合成,其他引物按照文獻(xiàn)[1-3]報(bào)道序列進(jìn)行合成。其中T3SS1、T3SS2α和T3SS2β各自有4個(gè)目的基因,任何一個(gè)目的基因檢測(cè)陽性,判斷相應(yīng)基因陽性。T3SS1包括VP1670/VP1686/VP1689/VP1694,T3SS2α包括VPA1327/VPA1335/VPA1339/VPA1362,T3SS2β包括Be ta_vscC2/Beta_vscS2/Beta_vopB2/Beta_vopC。tlh/tdh/trh、orf8、T3SS1、T3SS2α反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min;94℃變性30 s,45℃退火60 s,72℃延伸3 min,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。toxRS/new、T3SS2β反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,60℃退火60 s,72℃延伸3 min,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
應(yīng)用SPSS 20.0進(jìn)行分析,組間比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 tlh/tdh/trh基因
食品來源的83株和患者來源的77株菌株都檢出tlh基因,檢出率為100%,確認(rèn)160株細(xì)菌都是副溶血性弧菌;沒有菌株檢出trh,trh檢出率為0。tdh基因的檢出率合計(jì)為38.13%,食品來源菌株的tdh攜帶率(8.43%)明顯低于患者來源菌株(70.13%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=64.452,P<0.05)。見圖1A和表1。
2.2 orf8基因
orf8基因的總檢出率為14.38%,食品來源菌株的orf8攜帶率(3.61%)明顯低于患者來源菌株(25.97%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.224,P<0.05)。見圖1B和表1。
2.3 toxRS/new基因
toxRS/new基因的總檢出率為6.88%,食品來源菌株的toxRS/new攜帶率(10.84%)明顯高于患者來源菌株(2.6%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.242,P<0.05)。見圖1C和表1。
2.4 T3SS1基因
T3SS1包括VP1670/VP1686/VP1689/VP1694,所有菌株都檢出了這4種基因,檢出率為100%。見圖1D和表1。
2.5 T3SS2α基因
T3SS2α包括VPA1327/VPA1335/VPA1339/VPA1362,總檢出率為52.50%,食品來源菌株的T3SS2α攜帶率(19.28%)明顯低于患者來源菌株(88.31%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=76.336,P<0.05)。見圖1E和表1。
2.6 T3SS2β基因
T3SS2β包括Beta_vscC2/Beta_vscS2/Beta_vopB2/Beta_vopC,只有1株菌檢出Beta_vopC,總檢出率為1.67%,食品來源菌株的毒力基因T3SS2β攜帶率(1.2%)略高于患者來源菌株的攜帶率(0),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1F和表1。
圖1 2017—2018年大連市兩種來源的副溶血性弧菌各毒力基因毛細(xì)管電泳結(jié)果
注:M-marker;S—樣本;NTC—陰性對(duì)照;PTC—陽性對(duì)照。
表1 2017—2018年大連市兩種來源的副溶血性弧菌各毒力基因檢出情況[株(%)]
2.7 合并分析
兩種來源的副溶血性弧菌各毒力基因攜帶情況,食品來源菌株tdh-/trh-/orf8-/toxRS/newT3SS2α-/T3SS2β-的比例(68.67%)明顯高于患者來源菌株(6.49%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=65.071,P<0.05)。兩種來源菌株tlh、T3SS1攜帶率都為100%,trh攜帶率為0。此外,兩種來源菌株都沒有同時(shí)檢出tdh和toxRS/new基因。
3 討論
副溶血性弧菌是沿海甚至內(nèi)陸地區(qū)常見的食源性致病菌,但多數(shù)菌株不致病,只有少數(shù)有毒力的菌株才會(huì)致病[1]。副溶血性弧菌由多個(gè)毒力因子共同發(fā)生作用而導(dǎo)致人體疾病,比較常見的毒力因子包括黏附因子、侵襲因子、溶血毒素、脂多糖、蛋白酶、尿素酶、外膜蛋白及分泌系統(tǒng)等,分別由相應(yīng)的基因編碼[2]。
tlh是副溶血性弧菌的一種特異性基因,編碼TLH。TLH本身并不具有溶血活性,目前還不明確TLH是否具有致病性。所有的副溶血性弧菌均含有tlh,因此經(jīng)常用該基因進(jìn)行副溶血性弧菌鑒定。但是有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)副溶血性弧菌和溶藻弧菌的tlh基因在同源性上可達(dá)60%~70%,所以具有tlh基因能否判定為副溶血性弧菌,還需進(jìn)一步檢測(cè)[3]。本次分析中83株食品來源和77株患者來源的菌株均檢出tlh基因,且這些菌株生化鑒定結(jié)果都是副溶血性弧菌,所以該160株菌株均為副溶血性弧菌。
tdh和trh分別編碼耐熱直接溶血素(thermostable direct hemolysin,TDH)和耐熱相關(guān)溶血素(thermostable related hemolysin,TRH)。TDH和TRH被認(rèn)為是副溶血性弧菌最主要的毒力因子,TDH具有溶血活性、細(xì)胞毒性、心臟毒性以及致死性;TRH具有溶血性和腸毒素作用。一般以有tdh和trh基因作為判定副溶血性弧菌是否有致病性的標(biāo)準(zhǔn)[4]。研究顯示,絕大多數(shù)的患者來源菌株攜帶tdh基因,少數(shù)菌株攜帶trh基因,極少數(shù)同時(shí)攜帶tdh和trh[5],而在外環(huán)境和食品分離株這2種基因的攜帶率均很低[6]。本次分析中食品來源的菌株tdh攜帶率為8.43%,明顯低于患者來源的菌株(70.13%);兩種來源的菌株均未檢出trh基因,與文獻(xiàn)[7-9]報(bào)告的結(jié)果相似。表明食品來源的菌株獨(dú)力較弱,而患者來源的菌株毒力較強(qiáng)。但是實(shí)驗(yàn)敲除tdh和trh基因后,菌株還有細(xì)胞毒性,腸毒性沒有完全消除只是減弱,說明副溶血性弧菌還有其他的致病因子[10-11]。
1996年后,副溶血性弧菌出現(xiàn)了大流行株(高致病株03∶K6)[12]。是大片段的基因片段轉(zhuǎn)移形成了新O3∶K6型菌株,如toxRS/new序列、orf8基因(位于f237噬菌體上)[13]。一般認(rèn)為同時(shí)檢出毒力基因tdh和toxRS/new判定為大流行株[14];僅檢出tdh或trh判定為致病株。本次分析發(fā)現(xiàn)食品來源菌株toxRS/new基因攜帶率為10.84%,明顯高于患者來源菌株的檢出率(2.60%)。食品來源的菌株orf8的攜帶率(3.61%)明顯低于患者來源的菌株(25.97%),患者來源的菌株orf8的攜帶率低于文獻(xiàn)[15]報(bào)告的檢出率,而且兩種來源的菌株均未同時(shí)檢出tdh/toxRS/new,即未檢出大流行株。以上說明大連市兩種來源的副溶血性弧菌均不是大流行株。
Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)是沙門菌、志賀菌、耶爾森菌、副溶血性弧菌等腸道致病菌的重要毒力因子,與其致病性關(guān)系緊密。所有副溶血性弧菌都有的Ⅲ型分泌系統(tǒng)稱T3SS1,位于1號(hào)染色體上,表達(dá)的效應(yīng)蛋白介導(dǎo)宿主細(xì)胞自體吞噬導(dǎo)致細(xì)胞死亡,具有細(xì)胞毒性。T3SS2與tdh和trh都存在于2號(hào)染色體致病島(PAI)上,表達(dá)效應(yīng)蛋白VopA、VopC、VopL和VopT,具有腸毒性。T3SS2又可分為T3SS2α和T3SS2β兩個(gè)亞型,文獻(xiàn)研究顯示,T3SS2α存在于tdh+/trh-菌株中,T3SS2β存在于tdh-/trh+菌株中[16]。文獻(xiàn)研究顯示,環(huán)境和臨床分離株均攜帶T3SS1[17-19],本次分析中兩種來源的所有菌株均攜帶T3SS1基因。食品來源菌株tdh攜帶率為8.43%(7/83),T3S2α攜帶率為19.28%(16/83),tdh/T3S2α攜帶率為8.43%(7/83);患者來源菌株tdh攜帶率為70.13%(54/77),T3S2α攜帶率為88.31%(68/77),tdh/T3S2α攜帶率為70.13%(54/77)。可以看出兩種來源菌株的T3S2α的攜帶率均高于tdh檢出率,說明有些菌株雖無tdh基因,但是擁有T3S2α基因,即T3S2α也存在于tdh-/trh-菌株中。本次分析中兩種來源的160株細(xì)菌未檢出trh基因,只有1株食品來源的菌株檢出T3SS2β,說明T3SS2β也存在于tdh-/trh-菌株中。
食品來源菌株不攜帶tdh、trh、orf8、toxRS/new、T3SS2α、T3SS2β的菌株占68.67%(57/83),而患者來源菌株該比例為6.47%(5/77),說明食品來源副溶血性弧菌毒力基因攜帶率低于患者來源的菌株,且患者來源菌株除tdh、trh、orf8、toxRS/new、T3SS2α、T3SS2β還可能攜帶其他毒力基因。
本次分析結(jié)果表明,2017—2018年大連市兩種來源的菌株均不存在大流行菌株,都攜帶tlh和T3SS1,不攜帶trh;除toxRS/new外,食品來源的副溶血性弧菌毒力基因攜帶率明顯低于患者來源的菌株。
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文章名稱:大連市兩種來源副溶血性弧菌毒力基因的分析