摘 要：目的：研究磁珠法與煮沸法用于檢測(cè)乙型肝炎病毒(HBV)基因分型的檢出率，并探討基因分型檢出情況與HBV DNA定量間的關(guān)系。方法：2019年6月-2019年9月收治乙肝患者95例，隨機(jī)分為兩組，A組應(yīng)用磁珠法，B組應(yīng)用煮沸法對(duì)血漿進(jìn)行處理，提取HBV DNA后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行肝炎基因分型及DNA定量。比較兩組患者檢測(cè)結(jié)果并探討基因分型結(jié)果檢出率與HBV DNA定量水平的關(guān)聯(lián)。結(jié)果：A組患者B型、D型、B/C混合型及總檢出率均顯著高于B組，C型檢出率顯著低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩種方法檢測(cè)HBV基因型檢出率與HBV DNA水平呈正比，但應(yīng)用磁珠法對(duì)低DNA水平樣本的基因型檢出明顯優(yōu)于煮沸法。結(jié)論：磁珠法提取核酸陽(yáng)性率與靈敏度均較高，對(duì)于非C型及低病毒載量患者具有較高檢出率。 關(guān)鍵詞：磁珠法 煮沸法乙型肝炎病毒 基因分型 HBV DNA定量 乙型肝炎病毒(HBV)感染是導(dǎo)致乙型肝炎與肝癌死亡的最主要原因之一。相關(guān)研究指出，目前全球約有超過(guò)20億人感染過(guò)HBV，約有超過(guò)3.5億人為慢性HBV感染者。既往臨床多通過(guò)血清學(xué)方法對(duì)HBV進(jìn)行檢測(cè)，但檢出率相對(duì)較低，無(wú)法準(zhǔn)確地對(duì)HBV早期感染情況進(jìn)行反映，近年來(lái)隨著臨床對(duì)疾病研究的不斷深入，臨床人員逐漸發(fā)現(xiàn)基因分型與乙肝標(biāo)志物的表達(dá)、疾病的發(fā)生與進(jìn)展及肝硬化、肝癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、治療效果及預(yù)后均存在密切關(guān)聯(lián)[1-2]。選擇一種快速、簡(jiǎn)便的基因檢測(cè)方法對(duì)臨床用藥指導(dǎo)及評(píng)估預(yù)后具有重要意義。聚合酶聯(lián)反應(yīng)PCR可以快速、靈敏、特異性地檢測(cè)HBV DNA，尤其是實(shí)時(shí)熒光定量PCR可定量檢測(cè)HBV DNA，在乙肝的臨床診斷、治療監(jiān)測(cè)及預(yù)后評(píng)估方面起著重要作用，而在PCR測(cè)定準(zhǔn)確性方面，標(biāo)本HBV DNA的提取效率是重要因素。本文將95例患者分為兩組分別應(yīng)用磁珠法與煮沸法提取血漿并對(duì)HBV進(jìn)行分型，同時(shí)探討分型與HBV DNA的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。 資料與方法 2019年6月-2019年9月收治乙肝患者95例，男53例，女42例；年齡41～65歲，平均(53.2±12.0)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷均符合2015年修訂的《慢性乙型肝炎臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)》；(2)血標(biāo)本無(wú)溶血、無(wú)脂血，抗-HAV、抗-HCV、抗-HEV及抗-HIV均為陰性。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并嚴(yán)重心、肝、腎功能不全患者；(2)酒精性肝病、代謝性肝病及其他病毒感染導(dǎo)致的肝??；(3)精神疾病及意識(shí)障礙無(wú)法積極配合治療患者。所有參與本次研究患者均在知曉本次研究目的的前提下自愿簽署知情同意書(shū)，且本次研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。隨機(jī)分為兩組。A組48例，男25例，女23例；年齡41～65歲，平均(53.2±12.0)歲。B組47例，男28例，女19例；年齡40～66歲，平均(53.1±12.1)歲。兩組患者一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。 方法：抽取患者2～3 m L非抗凝血，保持轉(zhuǎn)速為3 600 r/min，離心時(shí)間≥5 min，分離出血清后將血清放置于-20℃冰箱中待檢。(1)A組患者應(yīng)用磁珠法檢測(cè)：根據(jù)試劑盒中說(shuō)明書(shū)要求，取血清標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照品各200μL后，添加已分裝好的核酸提取液在孔板當(dāng)中，根據(jù)設(shè)定的提取程序進(jìn)行自動(dòng)核酸提取并可獲得100μL核酸洗脫液，之后采用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行基因分型及DNA定量。(2)B組應(yīng)用煮沸法：根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行：提取標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照品各100μL，先后加入樣本處理液及核酸提取液進(jìn)行處理。100℃孵育10 min并保持12 000 r/min離心10 min，取上清液DNA采用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行基因分型及DNA定量。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件及結(jié)果判斷：于93℃對(duì)反應(yīng)管進(jìn)行保溫2 min，先按93℃45 s,55℃60 s循環(huán)10次；再按93℃30 s,55℃45 s，循環(huán)30次；在第2次循環(huán)55℃45 s時(shí)完成熒光檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后，可將拷貝數(shù)根據(jù)同時(shí)擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行自動(dòng)讀取。以臨界值1.00×102IU/m L為界線作為結(jié)果判斷，超過(guò)1.00×102IU/m L記為陽(yáng)性，未述到指標(biāo)則記為陰性。 觀察指標(biāo)：比較兩種方法檢測(cè)HBV基因分型結(jié)果，并探討基因檢出率與HBV DNA定量的關(guān)系。 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 20.0軟件處理；HBV DNA載量經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后以(±s)表示，應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；計(jì)數(shù)資料以[n(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 不同方法HBV基因分型結(jié)果比較：A組患者B型、B/C、D型混合型及總檢出率顯著高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);A組患者C型檢出率顯著低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。 表1 不同方法HBV基因分型結(jié)果比較[n(%)] 不同方法基因分型檢出率與HBV DNA定量關(guān)系：將A、B兩組患者的HBV DNA定量水平與基因型別進(jìn)行羅列后對(duì)比。從總檢出率來(lái)說(shuō)，兩種方法均表明HBV基因型檢出率與HBV DNA定量水平呈正比，但A組對(duì)于低DNA水平的樣本基因型的檢出明顯優(yōu)于B組。見(jiàn)表2。 表2 不同方法基因分型檢出率與HBV DNA定量關(guān)系[n(%)] 討論 近年來(lái)，隨著基因檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步與發(fā)展，分子生物學(xué)在各類(lèi)疾病的診斷、治療及評(píng)估預(yù)后中發(fā)揮著重要作用。血液中HBV DNA載量不僅能反映HBV復(fù)制程度與傳染性，也能反映抗病毒藥物療效與預(yù)后[3]。HBV基因檢測(cè)方法根據(jù)不同HBV基因型的差異序列設(shè)計(jì)一系列特異性引物，應(yīng)用基因型特異性引物PCR法進(jìn)行檢測(cè)。PCR擴(kuò)增后可獲得程度不同的片段并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行分型。這一過(guò)程中，關(guān)鍵步驟是HBV DNA的提取，檢測(cè)基因分型中起重要決定性的步驟為如何成功提取HBV DNA。既往臨床應(yīng)用煮沸法對(duì)血液中HBV DNA進(jìn)行提取，通過(guò)高溫煮沸后從病毒顆粒中釋放病毒DNA后，經(jīng)離心沉淀后DNA可存在上清液中。磁珠法通過(guò)裂解細(xì)胞充分幫助游離DNA特異性吸附在磁珠顆粒表面，蛋白質(zhì)等其他雜質(zhì)則留在溶液中，磁性顆?？稍诖艌?chǎng)作用下與液體分開(kāi)并經(jīng)過(guò)洗脫后得到病毒DNA[4-5]。本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用磁珠法提取HBV陽(yáng)性率在B型、D型當(dāng)中的陽(yáng)性率顯著高于煮沸法，而且低病毒載量也能檢測(cè)出基因型別，顯著提升了基因分型檢出率。這可能是由于煮沸法在高溫時(shí)可導(dǎo)致血漿蛋白凝固部分核酸被包裹，離心沉淀時(shí)發(fā)生丟失而減少上清液中核酸量，同時(shí)，煮沸法對(duì)血清標(biāo)本僅是從病毒顆粒中將病毒DNA釋放出來(lái)，離心后的上清液不僅有DNA，其他一系列影響PCR反應(yīng)的雜質(zhì)如血紅蛋白等也可能存在；而磁珠法通過(guò)磁性將DNA吸出可較好地將血清中雜質(zhì)進(jìn)行去除，對(duì)PCR反應(yīng)干擾較小，以促進(jìn)達(dá)到較好的檢出率[6]。同時(shí)，磁珠高效率的吸附核酸，跳過(guò)了煮沸法濃縮提取中核酸沉淀步驟；磁珠與DNA同時(shí)保留，進(jìn)一步減少了DNA丟失，達(dá)到核酸富集的目的。 綜上所述，磁珠法對(duì)HBV DNA并結(jié)合熒光PCR對(duì)檢測(cè)HBV基因分型具有較高檢出率，對(duì)HBV的檢測(cè)靈敏度明顯高于煮沸法，是一種更為理想的核酸提取方法，其應(yīng)用更可在慢乙肝患者抗病毒治療方案選擇、隱匿性HBV感染篩查、術(shù)前HBV檢查等方面提供重要的臨床價(jià)值。 參考文獻(xiàn) [1]李可可,劉瑩,姚品芳,等.中國(guó)人群乙型肝炎病毒基因分型不同方法和標(biāo)準(zhǔn)的比較[J].世界華人消化雜志,2014,22(16):2306-2316. 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